生物化学ppt 核酸2PPT.ppt

5.6.3、生物遗传变异的化学本质 ——DNA结构变化;1，DNA结构变化的类型及影响因素;? 某个碱基被调换，如AT换成GC；;③ 少了或多了一对或几对碱基，例如： 5’-ATGGCTATGC-3’ 变成 5’-ATGG TATGC-3’ 3’-TACCGATACG-5’ 变成 3’-TACC ATACG-5’;2. 基因突变;(2) 物理因素;当DNA受到大剂量紫外线（波长260nm附近）照射时，可引起DNA链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形成二聚体，例如TT二聚体。 ;X-射线以及放射性物质产生的辐射具有很高的能量，能直接引起DNA物理或化学性质的改变。另外，电离辐射也能使DNA周围环绕的其它分子（主要是水）产生具有很高活性的自由基，这些自由基能够进一步与DNA分子反应，导致DNA结构发生变化。 ;(3) 化学因素;① 烷基化反应;② 环外氨基的反应 ;;碱基类似物是一类结构与核酸碱基相似的人工合成或天然化合物，由于它们的结构与核酸的碱基相似，当这些物质进入细胞后能够掺入到DNA链中，干扰DNA的正常复制和转录。 常见的有碱基衍生物及稠环、稠杂环类化合物。例如5-溴尿嘧啶（5-BU），它与胸腺嘧啶碱基的结构相似，能取代T与A配对。 又如一种称为二恶英的含氯芳香杂三环化合物（2,3,7,8-四氯-二苯-二恶英，简称TCDD），是一种具有强烈致癌和致畸物质。它能够进入细胞并与DNA结合，导致DNA复制发生错误，从而可能诱发癌变。;5.6.4 核酸的催化性质;1．核酸酶的组成和结构;2．核酸酶的催化作用;在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。 ;（一）化学降解测序法;测序步骤： ①先用限制性内切酶把DNA切成100—200bp 的测序材料； ②用碱性磷酸化酶处理该片段，消除5′末端上的磷酸； ③在5′-OH端标记32P，用多核苷酸磷酸激酶催化； ④标记片段变性为单链； ⑤化学试剂在特定碱基位置降解单链DNA， 产生一组长度???等的DNA片段； ⑥经电泳和放射性自显影后，从4个反应系统统一阅读，待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出。 ;Maxam-Gilbert测序法的特异断裂;G反应：硫酸二甲酯，G碱基脱去，核苷酸链被切断。 G+A反应： 甲酸，A碱基脱去，但有部分G碱基也会脱去，核苷酸链被切断。 T+C反应：肼，T碱基脱去，但有部分C碱基也会脱去，核苷酸链被切断。 C反应： 在NaCl\肼，C碱基脱去，核苷酸链被切断。 ;5ˊP;;（二）Sanger末端终止法;;5ˊP;;;测序步骤：;（三）全自动DNA测序;四荧光标记的单泳道分离的测序原理;荧光标记物;聚合反应及产物;单泳道电泳及信号收集;计算机排序;;3730全自动测序仪;核酸研究新技术; 一 DNA重组技术;常见的名词:;克隆(clone)无性繁殖;绵羊“多利”;;主要步骤:; 逆转录法：;;2. 克隆载体的制备;存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。 具有自我复制功能。 带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。 经改造后具有多克隆位点。 举例：pBR322质粒;;pBR322质粒;3. DNA重组体的制备; 粘性末端 ;粘端连接;平端连接;限制性内切酶命名原则： 第一个字母（大写、斜体） 该酶的微生物属名 第二、三个字母（小写、斜体）代表微生物种名 第四个字母（斜体）代表寄主菌的株或型 用罗马数码I、II、III等区分同一株具有不同特异性的酶 ;重组体的转化;1)受体细胞的选择;2）转化方法;CaCl2处理;基因重组;含氨苄平板;在 DNA 重组载体设计时已经在质粒中装配了抗生素抗性基因标记，常见的有抗四环素抗性基因（Tetr ）、抗氨苄青霉素抗性基因 (Ampr) 、抗卡那霉素抗性基因（Kanr）等。 当带有完整抗性基因的质粒携带目的基因进入宿主后，细胞就具有了相应的抗生素抗性，如果在筛选平板的培养基中加入有关抗生素，只有含质粒的细胞才能生长。 但这种方法只能证明细胞中确实已经有质粒存在，但无法保证质粒中已经携带了目的基因。 为了防止误检，常采用插入缺失的方法，同一质粒往往有两种抗药性基因，在体外重组时将目的 DNA 插入到其中一个抗性基因中，使其失活，这样得到的宿主便可在含另一抗生素的培养基中存活，但在两种抗生素都