电泳技术(张华屏)PPT.ppt

电泳技术在分子生物学中的应用;电泳是带电荷的胶体颗粒在电场中的移动。 ; 以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。 ;重点内容;琼脂糖凝胶电泳;凝胶的制备 ????以琼脂糖为溶质，电泳缓冲液为溶剂，用微波炉加热，配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框，插入梳子，自然冷却。;缓冲液系统 ??? 常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等。 ;含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围;;样品配制与加样 ????DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有 0.25%溴酚蓝或其他指示染料，; 电泳 ?? 低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。 因此，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，所用电压不宜高于5V/cm。 cm ：电场正负极间的距离。????;染色和拍照 ???? 常用荧光染料溴化乙锭（EB）染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。;琼脂糖凝胶中DNA的染色 荧光染料溴化乙锭（EB） 含有一个可以嵌入DNA或RNA的堆砌碱基之间的一个平面基团 与核酸结合后在紫外线激发下呈现橘黄色荧光，荧光的位置代表核酸片段所在的位置，荧光的强弱代表核酸量的多少,可以检测到少至10ng的DNA条带。 可用于检测单链或双链核酸（DNA和RNA）。 ;将已知分子量的标准DNA的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知DNA片段在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得其分子量。;双链DNA分子在凝胶基质迁移的速率与碱基对数目的常用对数成反比。; 影响DNA 在琼脂糖凝胶中的迁移速率的因素 DNA分子的大小 琼脂糖浓度 ； DNA的构象 ：超螺旋环状（I型）、切口环状（II型）和线状（III型）；共价闭环DNA＞直线DNA＞开环双链DNA。当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNA（球形）不能进入胶中，相对迁移率为0，而同等大小的直线DNA（刚性棒状）可以按长轴方向前移，相对迁移率大于0。;凝胶和电泳缓冲液???的溴化乙锭; 所用的电压 ：低电压时，DNA片段迁移率与所用的电压成正比；电场强度升高时，高分子质量片段的迁移率遂不成比例的增加； 电泳缓冲液 ：组成和离子强度 。 ;聚丙烯酰胺凝胶 ;聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE） ; 与琼脂糖凝胶电泳的比较, PAGE的特点 分辨率很强，长度上相差1bp的DNA即可分开； 从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高，可适用于要求最高的实验（如胚胎注射）； 装载更多的DNA量； 最适合分离小片段DNA(5-500bp),可以分离蛋白质; 聚丙烯酰胺凝胶一律进行垂直电泳.;; 假如DNA 顺序中的某个碱基发生了突变，使突变所在部位的DNA 序列产生（或缺失）某种限制性内切酶的位点。这样，利用该限制性内切酶消化此DNA 时，便会产生与正常不同的限制性片段。这样，在同种生物的不同个体中会出现不同长度的限制性片段类型，即限制性片段多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP)。;点多态性实验方法;;;;SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳（SDS）的原理; 在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，同时，在强还原剂（beta-巯基乙醇）作用下，使半胱氨酸之间的二硫键断裂。 蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合(多肽和SDS的质量比为1:1.4)，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不同分子之间原有的电荷差异 。; 蛋白质-SDS复合物的形状近似于长的椭圆棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成比例。 因此，蛋白质-SDS复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质亚基分子量的大小。 当蛋白质分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。 ; 特点 大多在不连续缓冲体系中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液； 不连续缓冲体系具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故提高了SDS的分辨力； 系统中所有组分都含有0.1%的SDS。;负极; 配置