聚腺苷二磷酸核糖的聚合酶1抑制剂高通量筛选模型.doc

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1抑制剂高通量筛选模型 . 124.中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2007Jan;23(1):124～7 ◇实验方法学◇ 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶一1抑制剂高通量筛选模型 柳军,张陆勇 (中国药科大学新药筛选中心,南京江苏21ooo9) 中国图书分类号:R-332;R345.57;R392.11;R977.6 文献标识码:A文章编号:1001—1978(2007)01—0124—04 摘要:目的建立体外聚腺苷二磷酸核糖聚合酶一1[Poly (ADP.ribose)polymerase.1,PARP.1]抑制剂的高通量筛选模 型,筛选潜在的PARP?1抑制剂.方法将PARP-1,裸DNA 与底物NAD反应,再将剩余底物NAD转化为荧光物质, 通过测定其荧光强度来决定PARP.1的活性,并以此筛选 PARP一1的抑制剂.建立384孔板的高通量筛选模型,对 9280个化合物(包括合成化合物,天然产物,微生物发酵提 取物)组成的随机库进行体外筛选.结果筛选出148个活 性化合物对PARP.1的抑制作用大于70%,最终确定3个化 合物具有较高的抑制活性.结论建立的PARP.1抑制剂 高通量筛选模型具有灵敏度高,快速,微量,准确的特点. 关键词:PARP-1;抑制剂;高通量筛选 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[Poly(ADP?ribose)polymer. ase,PARP]也叫聚腺苷二磷酸核糖合成酶(PARS)或聚腺苷 二磷酸转移酶(PADPRT),是核酶的一种基本组成部分,包 括以下几个亚型:PARP.1,PARP.2,PARP.3,Vault.PARP和 Tankyrases(TANK-1,?2,和-3等亚型).其中,PARP.1是 具有1014个氨基酸,l13.ku的核酶,也是第一个报道的亚 型,它在体内含量最多,研究最深入,也最具有特异性.当 DNA损伤时,PARP酶被激活,与DNA结合,催化聚腺苷二 磷酸核糖基化,从而启动了DNA的损伤控制和修复过程. 但是它的过度反应将导致NAD/ATP能量耗尽,最终导致 细胞坏死.PARP-1的这种看似矛盾的双重作用引起生物学 家和药物化学家的广泛兴趣.因此,抑制PARP.1活性的小 分子化合物已经被广泛地作为抗肿瘤治疗,抑制神经损伤和 炎证损伤的药物研究,发现和寻找PARP酶的抑制剂具有重 要意义. 目前,高通量筛选(highthroughputscreening,HTS)是发 收稿日期:2006—07—07,修回日期:2006～09—25 基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)新型高通量筛选模 型,化合物库建设和药物筛选十五重大科技专项资助 项目(No2004AA234011);新世纪优秀人才支持计划资助 项目(NoNCET一04—0507) 作者简介:柳军(1970一),女,硕士,助理研究员,Tel:025.E—mail:junliu@cpu.edu.cn; 张陆勇(1962一),男,研究员,博士生导师,通讯作者,研 究方向:药物筛选,Tel:025现先导化合物的重要途径.但是,传统检测PARP一1活性的 方法主要是采用同位素标记NAD或抗体标记PARP酶方 法,成本高,操作繁琐,不适合高通量的筛选.本文应用荧光 检测方法建立了适合高通量的微量快速方法,并对9280个 样品进行了筛选. 1材料与方法 1.1材料与试剂PARP一1,activatedDNA从Trevigen公司 购买.苯乙酮,苯氨,菲啶酮[6(5H)-phenanthin0ne],3,4. 二氢-5?[4-(1-哌啶基)氧化丁基]?1(2H)?异喹啉酮(DPQ), 4一氨基-1,8萘二甲酰亚氨(4.AMINO.1,8-naphthalimide)从 Sigma购买.其它试剂均为市售分析纯.筛选样品为本中心 样品库保存样品,其中合成化合物4000个,天然提取物1280 个,微生物发酵提取物4000个.黑色384孔微板从Greiner bio?one公司购买.PARP缓冲液含有50mmol?Lriffs和2 mmol?LMgCl2(pH8.0).2mol?LKOH和20%苯乙 酮需避光保存,室温下1个月内稳定.50mmo|?L菲啶 酮,4-氨基一1,8萘二甲酰亚氨,DPQ用DMSO配制.5mmol ? L苯氨用PARP缓冲液配制. 1.2仪器HYDRAlI(Matrix,USA)全自动液体处理系 统,SAFIRE2(Tecan,Switzerland)多功能微孔板测读仪. 1.3NAD标准曲线的制备黑色384孔微板中加入25ul NAD,浓度分别为1,5,10,20,80,100,200,500nmol?L～. 每个