第08章 核酸药物与基因治疗PPT.ppt

第08章 核酸药物与基因治疗;第一节 基因工程原理简介;目的基因获得;第二节 基因工程中的方法学;真核细胞总RNA的电泳结果：;二、一些重要技术原理介绍 重点：DNA双脱氧测序技术，核酸探针技术，PCR技术等。（参见第5章） （一）DNA双脱氧测序 （二）核酸杂交技术 （三）PCR技术 ;（四）目的基因的改造技术 1. 引物介导的基因定点突变技术 2. 盒式突变(cassette mutagenesis) 3. Genes Shuffling;三、基因工程中的工具 （一）载体 1.质粒(plasmid) 2.粘粒(cosmid) 3.λ噬菌体(λ phage) （二）工具酶 1.限制性内切酶 2.外切酶 3.连接酶 4.聚合酶: klenow I 5.核酸酶 （三）宿主菌 DH5?, JM101, JM109; DE3等;四、获得目的基因的方法 基因文库（基因组文库和cDNA文库），化学合 成，PCR 等方法。还有DD-PCR以及基因芯片等技 术。 （一）基因组文库 目的：种质资源的保护；基因组测序；基因组 基因或调控序列的克隆等。;（二）cDNA文库的构建;五、表达载体（重组质粒）的构建与鉴定 1. DNA（载体和目的片段）的酶切与回收。 2. 目的片段与载体的连接。二者的摩尔比应满足以下 比例：粘端：3~5:1；钝端：6~8:1 3. 转化与重组质粒的筛选、鉴定。 1）初步鉴定：抗性；α-互补；快速鉴定；原位杂交；PCR。 2）酶切鉴定：大小和方向。 3）测序鉴定：双脱氧测序法。;六、基因导入技术 （一）细菌 1.氯化钙； 2.电穿孔技术。 （二）细胞 1.脂质体； 2.磷酸钙； 3.电穿孔； 4.显微注射； 5.Virus Vector。 （三）受精卵 1.显微注射； 2.电穿孔技术； 3.精子载体； 4.ESC； 5.Virus Vector（ RT-V or Lentivirus-V）。;七、常用表达系统 （一）原核表达系统：包涵体；分泌型。 已成功的基因工程产品绝大部分是利用原核系统生产的，如IFN、IL、TNF、G-CSF、GM-CSF等。 （二）真核表达系统：传代细胞；酵母；生物反应器等。 1. 传代细胞：如CHO、BHK、Vero、MDCK等； 2. 酵母：毕赤（甲醇）酵母。 3. 生物反应器：如乳腺、血液、尿液、鸡蛋、昆虫等。 世界上第一个动物（山羊）乳腺生物反应器产品—重组人抗凝血酶Ⅲ（商品名ATryn?）于2006年获准上市。由全球最著名的动物乳腺生物反应器研发企业——美国Genzyme转基因公司研制成功。;重组蛋白 动物 生产公司;蛋白/肽 公司 开发现状 治疗疾病;八、整合与表达的鉴定 （一）整合鉴定 1. PCR； 2. Southern and Dot blot； 3. Sequencing （二）表达鉴定 1. RT-PCR and Northern blot 2. RIA 3. SDS(Tricine-SDS) 4. HPLC 5. Western blot （三）提取纯化：参见第03章。 （四）检测鉴定：结构鉴定：序列；立体构象。活性测定：机体生理生化功能、性状的改变。