第四章 植物细胞培养方法(修改)PPT.pptVIP

（4）平板培养必须注意的方面 ①选用的培养基，无论是否条件培养基，必须是能够在低的初始植板密度下使细胞生长。 ②不要选用处在静止期过久的细胞。因为处在分裂旺盛时期的细胞才有最高的植板率。 ③在固体培养基中适宜的初始植板密度因植物种类而不同。如：烟草细胞适宜的为5~10 ×10 3 个/ml,若低于此数则植板率显著下降。 ④接种时培养基的温度要控制，一般不超过35 ℃ 。 问题？ 如果在琼脂培养基或液体培养基中，植板细胞的初始密度为1*105个/ml,植板后由相邻细胞形成的细胞群落常混在一起。 如果降低植板密度或完全孤立培养单细胞，则可避免这个问题，但是，当低于临界密度时，细胞就不能分裂，原因是什么？ 原因是植物细胞的生长繁殖需要一定浓度的某些内源化合物。 二.单细胞培养技术 2. 液体浅层培养 将悬浮在培养液中的细胞过滤，得到游离单细胞和小细胞团培养在浅层液体培养基中。 用途：主要用来增殖细胞 特点：有利于有毒物质的扩散； 有利于气体交换； 不利于定点观察； 单细胞生长、分裂后，难以得到单细胞系。 液体浅层培养 将悬浮在培养液中的细胞过滤得到游离单细胞和小细胞团 培养在浅层液体培养基中 液体培养基 用途：主要用来增殖细胞。 3、看护培养 Nurse callus Filter paper Single cell 单细胞无性系 恒温培养1个月 2~3月 用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使 其生长和增殖。这个愈伤组织称块为看护愈伤组织 二.单细胞培养技术 （1）看护培养的含义及用途 概念：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 用途：诱导形成单细胞系。 Muir(1954)首先用此法培养出烟草单细胞株。Sharp(1972)成功将此法用于番茄的花粉培养，诱导花粉形成单倍体细胞系。 二.单细胞培养技术 （2）看护培养基本技术 ①制培养基：在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。 ②接种愈伤和滤纸：在无菌的条件下，先将一小块（1cm）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm2）已灭菌的滤纸，然后放置一个晚上。 ③接种单细胞：将分离出的单个细胞接种到培养基的滤纸上。 ④恒温培养。 二.单细胞培养技术 （3）特点： ①效果好，易于成功。 ②简便易行。 ③不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。 注意：要得到单细胞系必须保证接种材料是真正的单细胞。 二.单细胞培养技术 （4）要求： ①看护愈伤组织处于活跃生长状态； ②愈伤组织和所要培养的细胞可以是同一个物种也可以不同。 离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看护培养下则分裂，为什么？ A.愈伤组织的存在给单细胞传递了某些生物信息； B.愈伤组织为细胞的生长繁殖提供了某些物质条件，主要是提供了营养物质和促进细胞分裂物质。 二.单细胞培养技术 4、微室培养 （1）微室培养的概念及用途 ①概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。 ②用途：主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。  （2）微室培养的技术 平视图 1滴含单细胞培养液 周围加石蜡油 凹穴载玻片 旁边加石蜡油 盖盖玻片 盖盖玻片 置培养皿中26~28 ℃恒温培养 二.单细胞培养技术 （3）微室培养特点：①能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成细胞团的全过程 ②培养基少，营养和水分难以保持，pH值变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。 二.单细胞培养技术 （4）微室培养要求： ①微室内不能有气泡。 ②最好微室的厚度不要超过20微米，盖 玻片 的厚度要在0.17~0.18毫米左右。 ③观察时要保持温度和培养时的一致。 二.单细胞培养技术 5、饲养层培养基技术 其方法是：作饲喂层的细胞经射线照射后．核失活不能分裂，但细胞仍存活。饲喂层细胞用平板技术制成一琼脂(糖)平板．此平板亦即“伺喂层”，然后将单离细胞以液体浅层或平板技术铺在饲喂层上。饲喂层的作用没有种的特异性，即以一种植物细胞制成的平板．可以支持另一种的生长。 二.单细胞培养技术 （三）影响单细胞培养的因子 1. 培养基成份 植板密度较高时，与悬浮培养中或愈伤组织中相似的培养基即可；较低时，则成份非常复杂，可加入椰子汁，水解酪蛋白或酵母浸出液等化学不明确物质； 二.单细胞培养技术 2. 初始细胞植板密度(临界密度) 临界密度：单细胞培养时，初始植板密度低于某值培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞团，则该值就是临界密度。 初始植板密度应根据培养基的营养状况而改变，培养基越复杂则植板细胞的临界密度越低，反之则相反。一般要求每毫升在1000个细胞以上。 二.单细胞培养技术 3. 生长激素? 加1种细