免疫学检测技术的基本原理课件.ppt

此法是测定抗体最常用的方法。 (2)免疫荧光技术 是用荧光素标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方法。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素、藻红蛋白等. 直接荧光法：检测不同的抗原，需要不同的特异性荧光抗体 间接荧光法：用一抗与样本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。此方法既可检测抗原又可检测抗体。若查抗原，一抗为已知的；若查抗体，抗原是已知的。一种荧光抗体可用于多种不同抗原的检测 (3)放射免疫测定法(RIA）：是用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来，具有重复性好、准确性高等优点. 用于激素、药物等微量物质的检测，敏感性可达到pg/ml水平。常用的放射性核素有131I和125I等。 (3)化学发光免疫技术（CLIA）： 将化学发光（如鲁米诺）分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。 特点：灵敏度高、特异性强 分离简便、自动化分析。 （4）免疫胶体金技术（ICS）： 用胶体金颗粒标记抗体或抗原，以检测未知抗原或抗体的方法称免疫胶体金技术。 （5）免疫印迹技术 又称Western blotting，是将十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离得到的蛋白转移到固相载体膜上，再用标记的特异性抗血清或单克隆抗体对蛋白质进行定性及定量分析的技术。敏感性为1～5ng。 免疫磁珠法:应用较广泛 是一种特异性分离所需淋巴细胞的方法。首先将特异性抗体（如抗CD3、抗CD4或抗CD8等）吸附在磁性微珠上，与待测细胞悬液中的相应细胞特异性结合后,再将磁珠结合细胞与未结合磁珠细胞分开，即可获得纯度高的所需细胞。 抗原肽-MHC分子四聚体技术 将特异性抗原肽段、可溶性MHC-Ⅰ类分子重链及β2微球蛋白在体外正确折叠，在亲和素存在下构建四聚体，并结合流式细胞仪定量检测外周血及组织中抗原特异性CTL的比率。 迟发型超敏反应（DTH） 体内检测细胞免疫功能的皮试方法原理：被抗原已致敏的机体，再用相同的抗原作皮试可导致迟发型超敏反应， 72小时后局部充血、渗出、红肿和硬结。细胞免疫正常者出现阳性反应，细胞免疫低下者则呈弱阳性或阴性反应。 淋转（标本片） 淋转（标本片） 淋转（标本片） 生物素(biotin，B) 生物素在机体内以辅酶形式参与各种羧化酶反应，故又称为辅酶R或维生素H。分子中有两个环状结构，其中I环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要部位；II环为噻唑环，上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构。 亲和素 (avidin，A) 与生物素结合后稳定，亲合素由4个相同的亚基组成，能结合4个分子的生物素。亲合素与生物素之间的亲和力极强，二者能快速结合，且反应不受外界干扰，具有高度特异性和稳定性。 火箭电泳 测吸光度 抗体 抗原 免疫复合物的浓度与透射光的衰减呈正相关。 免疫比浊法原理 免疫荧光技术 酶联免疫吸附试验(ELISA-间接法) 斑点金免疫层析试验 胶体金：氯金酸（HAuCl4）在还原剂的作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，因其在静电作用下而呈稳定的胶体状态，故称胶体金。 斑点金免疫层析试验 用胶体金作为标记物来检测抗原或抗体的方法。胶体金颗粒聚集后呈红色，可用于标记多种大分子，如白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、激素、脂蛋白、植物血凝素、卵白素等。 兔抗鼠IgG 鼠抗HCG单抗 金标鼠抗HCG单抗 尿液浸湿标志线 手持端 斑点金免疫层析试验（一） 斑点金免疫层析试验（二） 尿样 阳性 弱阳性 阴性 无效 免疫印迹法图解 裂解病毒 聚丙酰胺凝胶电泳 - + 95 68 45 12KD 电转印至NC膜上 置待测血清中，漂洗；加酶标抗抗体，漂洗； 加底物 显色 120 41 24KD 十二烷基磺酸钠SDS T细胞亚群的检测 抗凝血 分层液 抗凝血 血浆 白膜层 红细胞 离心 淋巴细胞的分离 T细胞亚群的检测——花环法（一） T细胞亚群的检测——花环法（二） PHA 　　　　　淋巴母细胞转化试验示意图 Ｔ细胞 Ｔ淋巴母细胞 　　　　　淋巴母细胞 操作流程 1.制备抗体包被板（试剂盒中所带） 2.加待测标本及对照品；加酶标记物 3.温育，37℃ 30min 4.漂洗（磷酸缓冲盐水） ,20s*5次 5.加底物(四甲基联苯胺)、显色剂(H2O2)37℃ 5