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血清饥饿法同步化牛卵巢颗粒细胞周期研究 　　 　　摘要：研究了体细胞制备过程中细胞培养时间、血清饥饿浓度和饥饿时间对体细胞周期同步化的影响。体细胞为牛卵巢颗粒细胞，细胞用碘化丙啶（PI）染色法，用流式细胞仪检测细胞周期。细胞传代培养至第２、１０和２５代，在０．５％和０．０５％的血清饥饿浓度下诱导处理２、３、４和５ ｄ。试验结果表明，第２、１０和２５代的细胞在Ｇ０／Ｇ１期的比例没有差异（Ｐ＞０．０５）。培养液中添加０．５％ ＦＣＳ和０．０５％ ＦＣＳ较对照组（１０％ ＦＣＳ）提高了细胞Ｇ０／Ｇ１期的比例（Ｐ＜０．０５），０．５％ ＦＣＳ和０．０５％ ＦＣＳ试验组获得了相近的细胞Ｇ０／Ｇ１期比例（Ｐ ＞ ０．０５）。血清饥饿至第5天的细胞较第2天的细胞有高的Ｇ０／Ｇ１期的比例（Ｐ＜０．０５）。结果显示，体外培养至不同代的牛卵巢颗粒细胞对Ｇ０／Ｇ１期的比例没有影响，血清饥饿和延长血清饥饿的时间能够有效诱导体细胞进入Ｇ０／Ｇ１期。 　　关键词：牛；颗粒细胞；血清饥饿；同步化；细胞周期 　　中图分类号：Ｑ８１３；Ｓ８２３．３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）08－1632-04 　　自１９９７年克隆绵羊Ｄｏｌｌｙ诞生以来，体细胞克隆技术得到了飞速的发展，已在许多动物中获得了成功［１－４］。在体细胞克隆研究中，供体细胞的选择和制备是提高体细胞克隆效率的关键步骤［５，６］。研究者从供体细胞的类型、供体来源、培养时间、核质同步化处理方法、培养液组成等方面进行了大量研究，以期获得最好的供体细胞来提高体细胞克隆的效率。在体细胞克隆过程中，供体细胞和受体细胞核质同步化是影响克隆效率的一个关键因素。处于Ｇ０／Ｇ１期的供体细胞通常被认为是理想的进行克隆研究的供体细胞，血清饥饿是诱导供体细胞进入Ｇ０／Ｇ１期阶段的主要方法［７－９］。虽然人们尝试使用不同的血清浓度和不同的血清饥饿时间来诱导供体细胞进入Ｇ０／Ｇ１期，也取得了不错的试验结果［１０，１１］，但很少将血清饥饿浓度、饥饿时间及细胞传代阶段与细胞周期的同步化做深入的关联分析研究。该试验研究了牛卵巢颗粒细胞制备过程中不同的血清浓度、血清饥饿时间以及体外培养时间对细胞周期同步化的影响。 　　１材料与方法 　　１．１材料 　　黄牛卵巢采自贵阳市某屠宰场；胎牛血清购自Gibco公司；DPBS、胰蛋白酶、DMEM、青霉素、链霉素、DMSO和透明质酸购自Hyclone公司；RNaseA、碘化丙啶（PI）和TritonX-100购自南京凯基生物工程有限公司。 　　１．2牛卵巢颗粒细胞制备 　　黄牛卵巢从屠宰场收集后装入加有１００ ＩＵ/ｍＬ 链霉素和１００ ＩＵ／ｍＬ青霉素的３０℃ 的ＤＰＢＳ中，于４ ｈ内运回实验室。将卵巢带回实验室后以ＤＰＢＳ清洗２次，从卵巢表面抽取卵泡液，取２ ｍＬ卵泡液用等量的０．２％透明质酸酶消化３ ｍｉｎ，用ＤＭＥＭ离心洗涤（１ ５００ ｒ／ｍｉｎ，６ ｍｉｎ）２次，然后用ＤＭＥＭ调整颗粒细胞的密度为１×１０６个／ｍＬ，将颗粒细胞移入加体积分数１０％ＦＣＳ、２ ｍmｏｌ／Ｌ谷氨酰胺、１００ ＩＵ／ｍL青霉素和链霉素的ＤＭＥＭ中进行培养。待细胞长至８０％～９０％时进行细胞消化传代培养。细胞消化用含０．１％胰蛋白酶和０．０２％ＥＤＴＡ的消化液，在３７．５℃下进行。细胞冷冻保存液是含有２０％（V／V） ＦＣＳ和５％ ＤＭＳＯ的ＤＭＥＭ。颗粒细胞培养至第２、１０和２５代，在０．５％和０．０５％ FCS浓度下分别处理２、３、４和５ ｄ以诱导颗粒细胞进入Ｇ０／Ｇ１期。 　　１．3ＰＩ染色法检测细胞周期 　　培养的牛卵巢颗粒细胞在３７．５ ℃下用０．１％胰蛋白酶和０．０２％ ＥＤＴＡ的消化液消化处理，然后移入５ ｍL离心管中用 ＤＰＢＳ离心洗涤（１ ５００ ｒ／ｍｉｎ，６ ｍｉｎ）２次，再用ＤＰＢＳ调整细胞浓度，使每个离心管中细胞的数目达到１×１０５个。细胞在４ ℃ 条件下加入３ ｍL预冷的 ７０％ 乙醇进行固定，过夜。固定后的细胞用提前预冷的ＤＰＢＳ洗涤离心２次，然后在每管中加入含有１ ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ 的０．５ ｍＬ ＰＢＳ，在３７ ℃的水浴中处理３０ ｍｉｎ。细胞染色是在４ ℃ 条件下以０．１ ｍｇ／ｍＬ ＰＩ 和０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００避光处理２ ｈ。染色处理结束的细胞用流式细胞仪检测其细胞周期。 　　１．4试验方法 　　１．4．１培养时间对体外培养的牛卵巢颗粒细胞Ｇ０／Ｇ１期的影响探讨牛卵巢颗粒细胞体外培养时间对其细胞周期的影响，分别将培养至第２、１０和２５代的牛卵巢颗粒细胞用０．５％ ＦＣＳ饥饿诱导处理２ ｄ，然后用ＰＩ染色法处理细胞，用流式细胞仪检测不同培养时间细胞的细胞周期。 　　１．4．２不同浓度的FCS对牛卵巢颗