发酵工程 第2章 菌种——种子的扩大培养（夏帆）.pptVIP

长江大学生科院生物工程系 　　　发酵工程 课件 Fermentation Engineering 对于不产孢子的赤霉素生产菌（Gibberelline fujikuroi），也可用大米固体培养基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种子罐种子。 不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌（Corynebacterium）、短杆菌（Brevibacterium），生产上一般采用斜面营养细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养，获得细胞悬液再接种。 种子的扩大培养 （四）种子质量控制 缬霉素发酵液中氨基氮的测定 氨基酸中的-NH3+基的pk值常在9.0以上，不能用一般的酸碱指示剂（包括酚酞），以氢氧化钠溶液作滴定测量。但可以用甲醛滴定法测量。在pH中性和常温条件下，甲醛迅速与氨基酸中氨基相互作用，使滴定终点移至pH9.0左右，在该过程中指示剂酚酞不与甲醛作用。pH9.0正是酚酞的变色范围，因此，可以用酚酞作为指示剂，以氢氧化钠溶液来滴定-NH3+基上的H+，每释放一个氢离子，就相当于一个氨基酸。 反应如下 R-NH3+ H++R-NH2 R-NH2+2CH3CHO R-N(CH2OH)2 实验步骤 1.将发酵液过滤，取滤液2.5mL于 250mL三角瓶中，加蒸馏水约50mL,加甲基红指示剂2~3滴，加1mol/LHCl溶液1～2滴，使成红色，放置3min. 2.以标准NaOH溶液滴定至刚好转橙黄色，读取此时滴定管刻度，加入12％中性甲醛10mL，放置5—10min。 3.加入酚酞指示剂1mL，用标准NaOH溶液滴定至呈微红色为终点，读取此时滴定管刻度。两次读数之差即为所耗NaOH毫升数。 结果计算 NNaOH×VNaOH × 14.01 NH-N%= × 100 2.5 单位：mg/100ml 湿度：斜面培养基的湿度对孢子的质量有较大影响，湿度低孢子生长快，湿度高孢子生长慢。在南方相对湿度控制在35％～42％。孢子数量最多，孢子颜色均匀，质量较好。　 如土霉素生产菌种龟裂霉菌的孢子，在北方干燥地区孢子斜面长的快，在含少量水分的试管斜面培养基中下部孢子长的好，而上部孢子稀少；气温高，湿度大的地区，斜面孢子长的慢，试管下部冷凝水多而不利于孢子形成。 思考题 1、何谓种子接种量、接种龄？ 2、影响种子质量的因素是哪些？ 3、保证种子质量有哪些措施？ 4、工业上接种的方法有哪些？ 舒琴， 林产化学与工业，2004 菌种为嗜碱性芽孢杆菌 镜检：24小时多个杆菌首位相连成线形，处于繁殖 旺盛期，30小时开始出现芽孢 返回 1、种子质量标准 2、影响种子质量的因素 3、种子质量的控制措施 ４、种子质量异常分析 ①生化指标 ②检查菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色泽、气味、浑浊度等） ③检查有无杂菌污染 ④产物生成量 ⑤其他参数　 1、种子质量标准 检测培养液中的糖 氨基氮 磷酸盐含量:萃取-磷钼蓝比色法 pH值 ①生化指标 3，5-二硝基水杨酸法 斐林试剂法 色泽、气味、浑浊度等 　　单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态； 　　霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。 ②检查菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 ④产物生成量 　　如，在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。 ⑤其他参数：如某些酶的活力、种子罐的溶氧和尾气等。 eg,土霉素生产的种子液中的淀粉酶活力与土霉素发酵单位有一定的关系。 ③检查有无杂菌污染 ④产物生成量 　　如，在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。 ⑤其他参数：如某些酶的活力、种子罐的溶氧和尾气等。 eg,土霉素生产的种子液中的淀粉酶活力与土霉素发酵单位有一定的关系。 ③检查有无杂菌污染 2、影响种子质量的因素 ①原材料质量 ②种龄 ③培养条件 ④斜面冷藏时间 2、影响种子质量的因素 2、影响种子质量的因素 生产过程中经常会出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动：产地、品种、加工方法等。 e.g1：四环素、土霉素斜面用麸皮：小麦产地、品种、加工方法及用量影响孢子的质量。