脂多糖对人牙周膜干细胞增殖及炎性因子表达影响.docVIP

脂多糖对人牙周膜干细胞增殖及炎性因子表达影响 　　[摘要] 目的 观察牙龈卟啉单胞菌脂多糖（LPS）对人牙周膜干细胞（HPDLSCs）增殖及炎性因子表达的影响。方法 培养和鉴定HPDLSCs。实验分为3组，A组采用含有10 μg·mL-1 LPS的α-MEM培养液培养HPDLSCs，B组采用含有 　　10 ng·mL-1 LPS刺激单核细胞的上清液培养HPDLSCs，C组采用α-MEM培养液培养HPDLSCs。MTT法检测HPDLSCs的增殖能力，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测HPDLSCs白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA的表达。结果 HPDLSCs具有克隆形成能力和骨向及脂向分化能力。与C组相比，A组和B组均抑制HPDLSCs的增殖，且B组比A组的抑制作用更明显（P 　　10-6 mol·L-1、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤125×10-6 mol·L-1、胰岛素10 mg·L-1、α-MEM培养液）培养，隔日换液。培养3周后吸弃培养液，PBS清洗，10%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗2次，油红O染色10 min，去离子水清洗3次。对照组仅用α-MEM培养液，其他步骤不变。倒置显微镜下观察。 　　1.4 MTT法检测HPDLSCs的增殖能力 　　实验分为3组，A组用含有10 μg·mL-1 LPS的α-MEM培养液培养HPDLSCs，B组采用含有10 ng·mL-1 LPS刺激单核细胞的上清液培养HPDLSCs，C组（对 　　照组）采用α-MEM培养液培养HPDLSCs。LPS刺激单核细胞上清液的制备方法：分离人外周血单核细胞，用含有10 ng·mL-1 LPS的α-MEM培养液37 ℃培养3 d，收集培养上清液，经0.22微孔滤膜过滤后置冻存管中-20 ℃保存备用，复温至37 ℃解冻可用。 　　每组取第3代HPDLSCs接种于每孔2×103个细胞的96孔培养板内。隔日换液，每日每组分别取5个复孔，MTT法测各孔光密度（optical density，OD）值，连测 　　7 d，以时间为横轴、细胞数为纵轴绘制生长曲线。 　　1.5 RT-PCR检测HPDLSCs的IL-1β、IL-6和TNF-α 　　mRNA的表达 　　实验分组方法同1.4。采用Trizol总RNA一步法提取细胞RNA。cDNA合成体系为20 μL，按照逆转录试剂盒说明书，采用随机引物法将RNA逆转录为cDNA，-20 ℃保存备用。参照GenBank数据库，采用Primer primer 5.0计算机软件设计引物，基因序列见表1。引物由Takara公司合成，反应条件参考产品说明书。PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。循??35次，72 ℃检测信号。以β-actin为内参照。反应结束后在PCR仪上自动读取阈值Ct。每例样品及阴性对照均设5个平行复孔，取均值。 　　1.6 统计学分析 　　采用SPSS 17.0软件进行统计分析，两独立样本均数比较用t检验，检验水准α=0.05。 　　2 结果 　　2.1 HPDLSCs的分离及培养 　　原代细胞培养3～7 d时，组织块周围有细胞爬出（图1左），2周左右可达80%汇合。细胞呈圆形、多角形等多种形态，但都表现为胞核聚集在中心，胞质形成的突起向外呈放射状，具有成体干细胞的特征（图1右）。 　　2.2 HPDLSCs的鉴定 　　2.2.1 HPDLSCs克隆形成率 培养7～10 d时，细胞克隆形成，镜下观察细胞呈集落状生长，形态成梭形，体积较小，排列紧密，中心细胞界限不清，呈圆形或不规则形状，周边细胞呈梭形或多角形（图 　　2）。HPDLSCs的克隆形成率为38%±1.21%。 　　2.2.2 成骨诱导 成骨诱导液连续培养7 d后，细胞呈复层生长，局部增厚；14 d左右，中央出现许多颗粒样改变，并逐渐连接成片；21 d左右，孔板底部出现肉眼可见针尖大小灰白色小结节，并逐渐增大。茜素红染色可见红色矿化结节（图3左），表明HPDLSCs 　　具有骨向分化能力。对照组的细胞成复层生长，未见矿化结节形成（图3右）。 　　2.2.3 成脂诱导 成脂诱导液连续培养7 d左右，可见细胞形态发生改变，至21 d时油红O染色阳性，细胞胞浆内有大量脂滴形成（图4左），表明HPDLSCs具 　　有脂向分化能力。对照组的细胞成复层生长，未见脂滴形成（图4右）。 　　2.3 HPDLSCs的增殖能力 　　与C组相比，A组和B组均抑制HPDLSCs的增殖，且B组比A组的抑制作用更明显，差异均具有统计学意义（P 　　IL-6、TNF-α是淋巴细胞、