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运动训练对糖尿病大鼠心肌纤维化改善作用及其可能机制 　　摘 要：通过高脂喂养加腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ）构建2型糖尿病大鼠模型，探讨运动训练对2型糖尿病大鼠心肌纤维化的改善作用。结果发现：与正常对照组相比，糖尿病对照组血液GLU、GHb、GSP和INS水平及心肌AGEs、Hyp、CVF、GSSG/GSH、MDA和NF-κB P65蛋白表达均显著升高（P 　　关 键 词：运动生物化学；2型糖尿病；运动训练；心肌纤维化；氧化应激；大鼠 　　中图分类号：G804.7 文献标志码：A 文章编号：1006-7116（2013）02-0130-05 　　心肌纤维化是糖尿病心肌病变时的重要特征之一[1]。心肌纤维化可增加心室壁的僵硬度，降低心室顺应性而导致心室收缩及舒张功能不全，心功能下降，并最终导致心力衰竭。因此心肌纤维化成为近年来糖尿病心肌病研究领域的一个热点。Castellar等[2]和Searls等[3]分别通过天狼星红染色技术和透射电子显微镜技术观察到运动可显著改善糖尿病大鼠心肌纤维化，但具体机制的研究却很少见。本研究通过高脂喂养加腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ）构建2型糖尿病大鼠模型，观察运动对2型糖尿病大鼠心肌纤维化的影响，并对其作用机制进行探讨。 　　1 材料与方法 　　1.1 造模与分组 　　雄性SD大鼠45只（SPF级，6周龄，体重（160～180） g；购自郑州大学医学院实验动物中心，许可证号：SCXK（豫）2010-0002）。大鼠分笼饲养，自然昼夜节律变化，自由饮食。室温（23±2） ℃，相对湿度40%～60%。高脂饲料配方：64.8%基础饲料，20%蔗糖，10%猪油，5%蛋黄粉，0.2%胆酸钠（质量比）。高脂饲料由郑州大学医学院实验动物中心配制。 　　参照Reed等[4]、Srinivasan等[5]方法建立2型糖尿病大鼠模型。SD大鼠普通饲料适应性喂养1周后，随机分成正常对照组（10只）和高脂饮食组（35只）2组，正常对照组继续饲喂普通饲料，高脂饮食组改为高脂饲料喂养。饲喂6周后，高脂饮食组通过口服葡萄糖耐量试验和胰岛素敏感性试验证实产生胰岛素抵抗后，过夜空腹12 h，腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ，30 mg/kg），72 h后检测大鼠随机血糖，随机血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病大鼠暂时成模标准，剔除血糖不达标大鼠。1周后复查暂时成模大鼠，随机血糖仍???16.7 mmol/L为建模成功。共有33只大鼠造模成功。将造模成功大鼠随机分为糖尿病对照组（16只）和糖尿病运动组（17只）。 　　1.2 训练方案 　　糖尿病运动组大鼠进行不负重游泳训练，水温36℃，训练时间共12周，每周5 d。第1周15 min，以后以每周15 min递增延长，直到延长至每天90 min。大鼠游泳过程中若出现漂浮现象，采用人为驱赶的方式使其继续游泳。 　　1.3 主要试剂和仪器 　　STZ购自Sigma公司，兔抗NF-κB P65多克隆抗体、氧化型谷胱甘肽（GSSG）和还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所，血糖（GLU）、糖化血红蛋白（GHb）、糖化血清蛋白（GSP）、羟脯氨酸（Hyp）、丙二醛（MDA）和Masson染色检测试剂盒购自南京建成生物研究所，晚期糖基化末端产物（AGEs）、胰岛素（INS）酶联免疫检测试剂盒购自上海蓝基生物科技公司。 　　RT-2100C酶标仪（美国）、RT-1904C半自动生化分析仪（美国）、垂直平板电泳仪（北京市六一仪器厂）、半干印迹转移槽（北京市六一仪器厂）、高速冷冻离心机（Sigma）、722 紫外分光光度计（上海精工仪器有限公司）、MDF-382E（N）超低温冰箱（日本）。 　　1.4 取材和指标检测 　　实验过程中，糖尿病对照组和糖尿病运动组大鼠相继死亡9只，至12周游泳训练结束时，糖尿病对照组余13只，糖尿病运动组余11只。在游泳训练第12周周末，所有大鼠过夜禁食12 h后，将大鼠腹腔麻醉，剖腹，从腹主动脉取血，取部分全血用于GHb测定，其余全血3 000 r/min离心20 min，取血清置于-80 ℃冰箱保存待测。取部分左心室置于质量分数为4%多聚甲醛中固定以备Masson染色检测，另取部分左心室置于-80 ℃冰箱保存以做心肌AGEs、Hyp、MDA、GSSG和GSH含量和NF-κB P65蛋白Western blotting检测。 　　1）心肌Masson染色检测。 　　常规乙醇梯度脱水，石蜡包埋切片，片厚4 μm，Masson染色，中性树脂封片。染色结果：胶原纤维和胞核呈蓝色，胞质、肌纤维呈红色。在Olympus显微镜400倍光镜视野下，每张切片随机选出6个视野并获取图像，采用Image-Pro Plus Ve