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乳铁蛋白分离纯化方法研究 　　摘 要：牛初乳中含有极丰富的生物活性物质，是提取和利用乳铁蛋白的最适来源之一。乳铁蛋白的分离纯化方法较多，本文概述了盐析和有机溶剂法、超滤法、离子交换色谱法、亲和色谱法、吸附色谱法、固定化单克隆抗体法和混合模式扩张床吸附法等，就其工业化生产的前景进行了分析。 　　关键词：乳铁蛋白 分离纯化 方法 　　中图分类号：S5 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2013）04（b）-0002-02 　　20世纪40年代，从乳清蛋白中分离得到了一种含Fe3+红色蛋白，作为血清铁结合传递蛋白（TF）的类似物，称之为乳铁蛋白（1actoferrin，Lf），又称乳转铁蛋白，主要存在于大多数哺乳动物乳汁中的铁结合糖蛋白。Lf分子量约为80000u，多肽链上有两条糖链，包括半乳糖甘露糖N一乙酞半乳糖胺、岩藻糖以及涎酸等。由于Lf具有一些非凡的生理功能作用，能够促进铁吸收、广谱抗菌、免疫增强、抗病毒、抗癌等，所以应用高新技术对Lf的进行分离、纯化和综合利用的研究，成为食品界和乳品行业关心的热点问题。 　　人们采用各种各样的方法来分离提纯Lf，例如盐析和有机溶剂法、超滤法、离子交换色谱法、亲和色谱法、吸附色谱法、固定化单克隆抗体法和混合模式扩张床吸附法等等。 　　1 盐析和有机溶剂法 　　根据蛋白等电点沉淀原理，Lf等电点为7.8～8.0，由于各种蛋白等电点范围交叉分布，所以很难将一种蛋白完全沉淀析出。曲练达等[1]用两次（NH4）2SO4和一次乙醇沉淀分离纯化Lf，纯度达45%左右。邬向东等[2]以饱和（NH4）2SO4盐析分离，经Sephadex G-100葡聚糖凝胶过柱纯化，并利用聚乙二醇浓缩获得了Lf。盐析法比色谱法简单，易于操作，且成本较低，但此方法得率低，产品纯度不高。但适用于保健品和食品添加剂等纯度要求不高的行业。 　　2 超滤法 　　根据膜孔径不同来实现不同分子质量和形状的大分子的分离。日本学者岛崎敬选用孔径分别为l0PS、30PS、50PS、l00PS、300PS、1000PS和3000PS的七种系列超滤膜膜，以干酪乳清为原料，先截留小分子量，再截留大分子量，其分子量分别为104、3×104、5×104、105、3×105、106、3×106，生产Lf基料的回收率为69%。卢蓉蓉等[3]用超滤法从初乳中初步分离得质量分数为26%的Lf粗品，虽适合大规模生产，但还无法提取高纯度的Lf。为强化传质和分离过程，Brisson等[4]在分离过程中添加了一个外加电场强化膜通量，降低膜污染，可用于组分复杂的料液。Ndiaye等[5]用电场强化的超滤膜过滤分离Lf，但其中含有β-乳球蛋白等杂蛋白，产品纯度不高，需进一步纯化。超滤法不加热或不发生相变，适合热敏性功能性组分的分离。操作简便，费用相对较低，易于形成工业化规模，是生产食品用乳铁蛋白最具实现工业化潜力的方法之一。但纯度不如色谱法高，且膜孔堵塞需经常清洗，且不易清洗。 　　3 离子交换色谱法 　　3.1 传统离子交换色谱法 　　根据离子交换剂对不同离子或化合物的结合力不同实现物质分离，结合力的大小由离子交换剂决定。Grove使用DEAE纤维素阴离子交换树脂和磷脂纤维素交换色谱法分离出较纯的Lf。由Foley等[6]用羧甲基阳离子交换色谱法对此法加以改进，用pH值为7.7，浓度为0.05 mol/L磷酸钠或浓度为0.3 mol/L的NaCl洗脱液，把Lf分为a，b两种变异体，纯度为81%左右。树脂可用0.2 mol/LNaOH和0.2 mol/LHCI再生。徐丽萍[8]用Sephadex C-100柱，分别用含0.65 mol/LNaCl7.0，7.2，7.4和7.6的PBS缓冲液洗脱，得纯度为92%Lf。Maharjan等[7]用一种温度敏感型阳离子交换树脂，在50 ℃对Lf的最大吸附容量是20 ℃的3倍，通过调节温度选择性洗脱Lf。传统离子交换树脂虽然成本相对较低，但分辨率也较低，要得到高纯度的Lf需复杂分离工艺。 　　3.2 新型离子交换法 　　SPEC70SLS离子交换树脂是丙烯酸共聚合物，由一个AMPS（丙烯酰胺甲基-丙烷磺酸）多聚物和一个双功能试剂MBS（N，N-甲烷-双-丙烯酰胺）交联组成，拥有大孔通透性，能满足大面积表面接触和有效物质传送，实现蛋白的分离纯化，合成树脂可以数千次地重复使用。树脂吸附牛脱脂乳中的Lf可用330 mMNaCl洗脱，吸附容量为8.34 mg/g，纯度为96.7%，树脂对Lf的回收率为74.50%。SPEC70 SLS树脂被美国FDA认可为能与食品接触的物质，在工业化生产规模中具有巨大应用潜力。张振字等[9]采用强阳离子交换色谱梯度洗脱法，对牛乳中的乳铁蛋白进行分离和纯化。可较好地分