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地黄AuxIAA家族基因RgIAA1克隆和表达分析 　　[摘要] 为了克隆地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1，分析地黄RgIAA1的时空表达特性及对逆境胁迫的响应。以拟南芥AtIAA14的cDNA序列为探针在地黄转录组数据库中进行比对，应用生物信息学方法分析RgIAA1的序列特征及进化关系，以实时荧光定量PCR技术检测RgIAA1在地黄不同组织以及逆境胁迫下的表达量。结果表明，获得1条903 bp的cDNA序列，包含一个681 bp完整的开放阅读框（ORF），编码226个氨基酸，具有Aux/IAA家族蛋白的典型结构域和特征序列。RgIAA1在地黄不同组织中的表达呈差异表达，其中在地黄幼嫩叶片里表达强度最大，其次为茎，且随着叶片的伸展，RgIAA1表达强度不断降低。在连作时RgIAA1的表达量升高，NaCl和渍水胁迫下RgIAA1的表达量降低。实验首次克隆了地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1，为阐明其在地黄生长发育和逆境胁迫中的分子功能奠定基础。 　　[关键词]地黄；Aux/IAA家族基因；序列特征；表达分析 　　地黄Rehmannia glutinosa L.为玄参科多年生草本植物，以块根入药，为著名的“四大怀药”之一。随着分子生物学技术的快速发展，地黄的基因信息解析逐渐成为研究的热点。然而迄今为止，地黄基因克隆的报道较少，有肌动蛋白基因片段[1]、RgPR210基因[2]、转座酶基因[3]、扩展蛋白基因RgEXPA1[4]和3-酮酯酰CoA-硫解酶基因RghKAT[5]等。 　　生长素可直接作用于细胞膜或细胞内组分，参与植物整个生命周期的生长发育调控。生长素的信号转导途径包括信号识别、生长素相关基因的表达及植物表现生理响应[6]。Aux/IAA（auxin/indoleacetic acids protein）和ARF（auxin response factor）是生长素信号转导必需的两类转录因子家族[7]。Aux/IAA在植物中有多个成员组成，如从拟南芥Arabidopsis thaliana、水稻Oryza sativa、毛果杨Populus trichocarpa和高粱Sorghum bicolor中分别鉴定出29，31，25，25个Aux/IAA基因。Aux/IAA蛋白家族成员多包含4个高度保守的结构域，结构域I具有转录抑制功能，结构域II能够维持Aux/IAA蛋白的稳定性，结构域III，IV负责与Aux/IAA蛋白或ARF蛋白形成同源和异源二聚体[8-9]。薛建平等[10]检测了地黄不同组织、不同生长时期的IAA含量，推测IAA调节特异的mRNA合成，促进不定根膨大形成块根。AtIAA14控制拟南芥的侧???发育[11]，并且参与缺磷响应[12]，是一个重要的功能基因。为了研究Aux/IAA基因在地黄生长发育的分子功能，本研究以AtIAA14的cDNA为查询序列，应用电子克隆结合PCR扩增技术，克隆了一个地黄Aux/IAA基因，命名为RgIAA1。应用生物信息学和实时荧光定量PCR方法，分析其序列特征和基因表达模式，为地黄Aux/IAA基因在地黄块根膨大、活性成分积累以及逆境胁迫等发育进程中的分子功能研究奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1样品和胁迫处理 克隆基因和胁迫处理均选用怀地黄优良品种“温85-5”为材料，经河南农业大学高致明教授鉴定为R. glutinosa。所有实验材料均种植在直径14.5 cm、高15.5 cm的聚乙烯塑料盆里，在光照培养箱（LRH-300-G，广东医疗器械厂）里生长，温度为25 ℃，光照强度为2 000～4 000 lx，光照时数14 h。 　　实验设置3种处理：①连作胁迫。以至少10年未种植过地黄的土壤为头茬栽培处理，以上年种植过地黄的土壤为连作栽培处理。在头茬和连作处理的土壤中种植地黄种栽（块根），出苗后70 d取叶片用于基因表达检测。②盐胁迫。以2%的NaCl溶液浇灌头茬土盆栽种植45 d的无菌组培苗，12 h后取叶片用于表达分析。③渍水胁迫。自来水浇灌头茬土盆栽种植45 d的无菌组培苗，水层高于土表2 cm左右，连续3 d后取叶片用于表达分析。盐胁迫和渍水胁迫均以未处理的无菌组培苗为对照。 　　1.2RNA提取与反转录 从“温85-5”幼苗中提取总RNA。每个植物样品取材约50 mg，以Trizol提取液（Invitrogen， 上海）提取地黄总RNA，提取方法参考说明书进行。反转录采用反转录试剂盒（Invitrogen， 上海），用于cDNA第一链合成需要3 μg 的RNA，0.5 μg的Oligo（dT）12-18引物，RNase抑制剂，M-MLV反转录酶，终体积为20 μL，37 ℃条件下反应50 min，然后70 ℃加热15 min终止反