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从线粒体DNA研究亚低温脑保护机制 　　【摘要】 目的 探讨亚低温对创伤性SD大鼠线粒体DNA的脑保护机制的研究。方法 ⑴ 实验动物分组：常温创伤性脑损伤组、亚低温创伤性脑损伤组二组。⑵ 各组按照处死时间点不同分为2h、24h和3d 3个亚组，每个亚组6只大鼠。结果：亚低温组DNA的缺失明显少于常温组。结论：亚低温能抑制脑线粒体DNA的死亡，从而起到很好的脑保护作用。 　　【关键词】 亚低温；线粒体DNA 　　【中图分类号】Q5 【文献标识码】B【文章编号】1005-0019（2013）12-0523-02 　　创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）占全身各部位损伤的第2位，病死率却达30%-50%左右，居第1位.创伤性脑损伤是一种常见的神经外科疾病，流行病学调查资料显示， 当今我国颅脑外伤的发病率已经超过100/ 10 万人口， 伤数百万人，接近西方发达国家150～200/10 万人口，且随着社会的发展而逐渐增加[1]。TBI不仅发生在损伤瞬间，且发生于其后的数分钟到数天内，称为继发性脑损伤（SBI）。 　　国内江基尧教授等研究表明，应用亚低温治疗患者预后明显改善，显著减少脑损伤的死残率，但亚低温脑保护机制仍未完全明了，亚低温脑保护作用机制仍待研究 [2]。 　　我们本课题针对对创伤性SD大鼠线粒体DNA进行研究，研究亚低温治疗后能否减轻线粒体DNA的缺失，能否保护线粒体的功能，改善预后，现报道如下： 　　1.资料与方法 　　（1）实验分组：常温创伤性脑损伤组、亚低温创伤性脑损伤组。 　　（2）外伤模型制作：各组按照处死时间点不同分为2h、24h和3d，每个亚组6只SD大鼠。大鼠用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉后，在大脑左顶（前囟后4.5 mm，矢状缝旁左开3.5 mm）钻孔，约5mm2，避免损伤硬脑膜。假手术组只在颅骨上打孔不给予外伤打击，常温TBI组和亚低温TBI组用液压冲击伤装置进行打击，压力1.5 x 102 - 1.7 x 102 kPa，作用时间21～23 ms，造成中度颅脑创伤模型。亚低温TBI组伤后即刻连续给予脑室内物理降温，持续2h后复温至37℃ 　　（3）亚低温模型制作：亚低温组实验大鼠打击模型制作成功后，将温度探头埋于损伤灶皮质下2 mm处，经骨窗穿刺置入两根微型脑室管分别至双侧侧脑室并固定之，其中一根脑室管接一套输液器，另一根脑室管接一引流管，将25℃ 的林格氏液自脑损伤后30 min开始通过输液器流入侧脑室冷却脑脊液，利用其循环途径使脑组织迅速进入亚低温状态（3l～33℃），林格氏液再从另一根脑室管通过引流管排出。根据脑温监测仪所显示的脑温变化及颅内压监测情况适时调节水流速度，确保实验动物脑温在规定的时间内（20～30 min）降低至亚低温水平，并保持这一脑温达2h，然后用骨蜡封闭骨窗、缝合头皮并再次消毒后放入笼中，采用自然复温法使实验动物脑温恢复正常 　　2.脑线粒体的分离及线粒体DNA的提取 　　（1）脑线粒体的分离（参考文献： Palva T K， Palva E T. Rapid isolation of animal mitochondrial DNA by alkaline extraction[J]. FEBS，1985，192（2）；267） 　　（2） 线粒体DNA的提取（【参考文献】Krlstian T，Weatherby TM，Bates TE，et a1.Heterogeneity of the calcium-induced permeability transition in isolated non―synaptic brain mitochondria.J Neurochem，2002，83：1297―1308）： 　　3.PCR检测线粒体DNA 　　参照大鼠线粒体DNA全序列（参考：Richer C，Park J W，Ames B N. Nomal oxidative damage to mitochondrial and nuclear DNA is extensive[J].Proc Natl Acad Sci USA，1988，85（17）；6465），自行设计，由中国科学院上海细胞所合成两对引物。 　　P1 GCTTAGAGCGTTAACCTTTTAAG （5’―3’） 　　P2 AAGCCTGCTAGGATGCTTC （5’―3’） 　　P3 ACAGGCATCTGGTTCTTACT （5’―3’） 　　P4 CATGTCTAATCTTACCTCCA （5’―3’） 　　引物P1、P2 横跨mtDNA常见缺失区，分别对假手术组、常温创伤性脑损伤组、亚低温创伤性脑损伤组进行扩增