肠致病性大肠杆菌045ler基因缺失突变菌株的构建及其特性的分析-construction and characterization of a mutant strain of enteropathogenic escherichia coli 045 ler gene deletion.docxVIP

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2018-06-28 发布于上海
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肠致病性大肠杆菌045ler基因缺失突变菌株的构建及其特性的分析-construction and characterization of a mutant strain of enteropathogenic escherichia coli 045 ler gene deletion

河北师范大学高校教师申请硕士学位论文中文摘要河北师范大学高校教师申请硕士学位论文中文摘要肠致病性大肠杆菌是能引起动物体内出血性和非出血性腹泻、出血性结肠炎和溶血性尿毒症的主要病原菌。最常见的菌株是045，而045的一个重要毒力特征是引起肠黏膜粘附和脱落损伤(A／E)，EPEC的主要毒力因子定位于致病岛 (Pathogenicity Island，PAls)和肠细胞脱落位点(The Locus of enterocyte effacement，LEE)上，其DNA长度为43kp，分LEEl，LEE2，LEE3，和LEE4四个基因区，LEEl包含ler(中心调节基因，LEE—encoded regulator)，ler对LEE 毒力基因群(LEE2、LEE3和LEE4)的表达起正调控作用，因此认为let是EPEC 毒力因子表达重要的中心调节基因。在本研究中，构建了045的ler基因缺失突变菌株并对其特性进行了研究：首先用PcR的方法扩增出缺失279bp ler的基因片段，将其克隆到自杀性载体 pCVD442中，构建了重组质粒pCVD442：：A ler，转化到宿主菌SMlOpir，然后通过接合性转导的方法将自杀质粒pCVD442：：△ler从SMlOpir转到0157：H7中，转导子过夜培养后铺平板，通过蔗糖筛选氨苄敏感的ler基因缺失突变菌株，并用PCR进行鉴定。用045(△let)细菌培养上清进行Vero细胞毒性实验，结果表明045ler基因缺失突变菌株对Veto细胞没有毒性作用，而野生型045对Vero 细胞具有较强的毒性作用。为了评价045(△ler)突变菌株的安全性，建立了 045感染的小鼠动物模型，对第一组小鼠口服接种045(△ler)，同时对第二组同龄小鼠口服接种野生型045。第二组小鼠体重减轻，并于4天内全部死亡，割检及病理切片检查肾脏、肝脏、肺脏和肠均出现明显病理变化。第一组小鼠生长正常，体重与阴性对照组小鼠相似，没有出现任何临床症状，14，天后剖检，各器官均未见病理变化。结果证实所构建的EPEC 045let基因缺失突变菌株无致细胞病变作用，并丧失了对小鼠动物模型的致病性，该菌株有可能成为预防猪EPEC 045感染的基因工程弱毒菌苗候选株。关键词：肠出血性大肠杆菌045 ler基因缺失突变河北师范大学高校教师申请硕士学位论文Abstract河北师范大学高校教师申请硕士学位论文AbstractEnteropathogenic Eschcrichia coti(EPEC)are important animal pathogens which are capable ofcausing bloody and nonbloody diarrhea,hernorrhagic colitis(HC) and potentially fatal hernolytic u／emic syndrome(HUS)．The most common serotypeof EPEC is 045．One of the important virulence trait of EPEC 045 is the capacity toproduce attaching and effacing(A／E)lesions on enterocyte．This property encoded by a 43kb pathogenicity island O Ar)termed the locus of enterocyte effacement(LEE)． ne genes ofLEE are organized into four polycistronic oporons：LEEl，LEE2，LEE3and LEE4．LEEl contains ler(LEE-encoded regulator)gene(previously known签 orn)．1er is the first open reading frame of LEE．The product of ler transcriptionally activates LEE2．LEE3 and LEE4．The ler gene product is a central up·}egulator ofmany ofthe virulence genes ofthe LEE．In this study,in order to obtain an attenuated vaccine candidate．a let deletionmutant of 045 was constructed．m fragment of internal 279bp dele