布鲁氏菌sran abcr1和靶基因的相互作用研究-interaction between brucella sran abc r1 and target gene.docxVIP

研究生优秀毕业论文布鲁氏菌sRNAAbcRl对靶基因的调控功能研究目录摘要iAd3STRACT．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．iii缩略语表(Abbreviation)v第l章文献综述一11．1．布鲁氏菌的分类和分布一l1．2细菌的sRNA51．3细菌sRNA靶位点的生物信息学预测一51．4研究目的和意义．6第2章材料和方法．．82．1实验材料一82．1．1实验菌株、质粒和培养基82．1．2实验仪器及耗材一82．1．3引物列表92．1．4工具酶和试剂盒、抗体等．102．1．5试剂、抗生素及培养基．102．2实验方法112．2．1布鲁氏菌总RNA提取ll2．2．25’RACE寻找TSS位点．．122．2．3PCR产物或者酶切产物的切胶回收142．2．4PCR产物或者酶切产物的无水乙醇法沉降回收142．2．5大肠杆菌TOPl0感受态细胞的制备152．2．6低拷贝载体质粒大量提取(invitrogen试剂盒)152．2．7Targets目的片段和pXG一10SF载体的连接．162．2．8sRNA目的片段和载体一步定向无缝克隆(novoprotein试剂盒)．162．2．9酶连产物或者一步定向重组产物的转化．172．2．10质粒小量提取(OMEGA试剂盒)172．2．1l超声波破碎大肠杆菌：．182．2．12Westernblot检测GFP蛋白含量l82．2．13qRT—PCR检测靶基因转录水平19第3章结果与分析2l3．1sRNA结构预测．213．2sRNA的保守性分析．223．3sRNA的靶位点预测．22万方数据华中农业大学2015届硕士研究生学位(毕业)论文3．4布鲁氏菌总RNA提取243．55’RACE寻找靶基因的5’转录起始位点一243．6sRNA的3个targets的扩增253．7绿色荧光基因的targets载体pXG一10SF的酶切验证263．8Target：：pXG一10SF融合后质粒的构建和荧光检测．273．9布鲁氏菌sRNAAbcRl和AbcR2的无缝克隆一283．10共转化Target：：pXG一10SF和AbcRl：：pZK001293．11Westernblot检测共转化的GFP蛋白水平一303．12qRT—PCR检测共转化质粒mRNA水平的变化量3l第4章讨论33第5章结论一35参考文献．．36附勇乏4l致谓}一46万方数据布鲁氏菌sRNAAbcRl对靶基因的调控功能研究摘要布鲁氏菌是一种革兰氏阴性兼性胞内寄生菌，能够引起人类和家畜的布鲁氏菌病，通过皮肤黏膜、呼吸道和消化道传播。羊、牛、猪等宿主被感染后，会出现流产和不孕不育等症状，而人则会出现关节炎、睾丸炎、波浪热、多汗等特征。布鲁氏菌感染机体后，能在机体内建立免疫逃避机制。最近研究表明，细菌中存在一类非编码的小RNA(smallnon—codingRNA，sRNA)，具有潜在的调控细菌代谢以及毒力相关基因作用。本课题组已有的RNA—seq分析预测表明，羊种布鲁氏菌的sRNAAbcR1极可能是具有调控功能的sRNA。布鲁氏菌的sRNA靶定其mRNAs然后发挥转录后调控作用。通过查阅文献同源性比对以及生物信息学预选定测AbcR1的三个潜在靶基因BMEll0923，BMEll0372，BMEll250。它们与布鲁氏菌MerR蛋白家族转录后调控、短链脱氢酶的活性、周质蛋白有关。通过RACE实验检测靶基因的TSS位点，测序验证后克隆相关靶基因，然后利用具有绿色荧光GFP报告系统的大肠杆菌质粒检测系统，将sRNA构建到具有氨苄青霉素抗性的质粒载体pZK001上，将备选targets构建到具有氯霉素抗性的质粒载体pXG—IOSF上，pXG—IOSF上具有superfolderGFP基因，可表达target：：GFP融合蛋白。通过共转化两种质粒得到菌落，检测GFP在特定激发光下的荧光强度；超声波破碎菌体后，Westernblot检测GFP蛋白的表达量：qRT—PCR检测靶基因的转录水平，由此推断GFP蛋白的转录和表达情况，从而分析sRNA对于target的调控作用。相关结论如下：1．TargetRNA2作为专门的细菌sRNA靶位点预测工具，能够用于布鲁氏菌靶位点的分析，例如sRNAAbcRl靶位点的相互作用预测，但预测结果需要更进一步的实验验证。2．羊种布鲁氏菌Brucellamenlitensis的sRNAAbcRl经验证是具有调控功能的非编码小RNA，能够下调靶基因BMEll0923的表达，也能够上调靶基BMEll0372的表达，但对于BMEll250的调控作用不明显。3具有GFP的质粒报告系统能够直观快速的反映羊种布鲁氏菌中目的sRNA和潜在靶基因的