产耐热α-葡萄糖苷酶重组大肠杆菌的构建及发酵条件优化分析-construction of recombinant escherichia coli producing thermostable α -glucosidase and optimization of fermentation conditions.docxVIP

产耐热α-产耐热α-葡萄糖苷酶重组大肠杆菌的构建及发酵条件优化研究绪论绪论5252 PAGE PAGE 13版权声明本论文及相关图表、数据、结果等内容，未经论文作者和导师允许，不得公开或转 载。特此申明。 1 绪论1.1 引言α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase, EC 3.2.1.20）又称麦芽糖酶（maltase）、α-D-葡萄糖 苷水解酶、转移葡萄糖苷酶。它可以从低聚糖的非还原末端切开 α-1,4 糖苷键，从而释 放出葡萄糖，也可以将游离出的一个葡萄糖残基转移到另一个糖类底物，形成 α-1,6 糖 苷键，得到非发酵性的低聚异麦芽糖或糖肽、糖脂等[1-3]。α-葡萄糖苷酶种类繁多，性质各异，在自然界分布广泛，几乎存在于所有生物体内。 它在生物体的糖类代谢方面具有重要的生理功能。研究表明人体对淀粉、糊精、蔗糖等 碳水化合物的利用和吸收都与小肠刷状缘上的 α-葡萄糖苷酶有关[1]，它们在被淀粉酶水 解后，进一步被 α-葡萄糖苷酶水解。α-葡萄糖苷酶应用于生产具有双歧杆菌增殖因子和抗龋因子双重功能的低聚异麦 芽糖领域[4-6]，受到食品工业界的重视。但生产过程中的环境条件对酶活影响很大，因 此，近年来来自嗜温和嗜热微生物的热稳定 α-葡萄糖苷酶的基本性质和及其工业应用倍 受关注。1.2 α-葡萄糖苷酶的理化性质α-葡萄糖苷酶的相对分子量一般在 40 000-150 000 Da 之间。不同来源的 α-葡萄糖苷 酶相对分子质量有很大的差异。即使是同一菌属的不同菌株或同一植物组织中的不同 α- 葡萄糖苷酶的相对分子质量也存在显著差异[7]。如日本天野制药株式会社生产的黑曲霉 α-葡萄糖苷酶的相对分子质量为 125 000 Da [1] ；而藤井聪等[8]从中国华南地区的粉葛根中分离出一株丝状真菌的 α-葡萄糖苷酶，其相对分子质量经凝胶色谱法测定为 57 000Da，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶法（SDS）测定为 60 000 Da。 已经发现的所有 α-葡萄糖苷酶的 pI 都在酸性范围之内，并且变化不大，最适 pH 可以超过 7.0，一般在 3.0-5.0 之间。枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 25S 和 Bacillus caldolyticus C2 的 pI 均为 4.85，最适 pH 分别为 7.5 和 7.0[1]，黑曲霉 α-葡萄糖苷酶的 PAGE PAGE 10 PAGE PAGE 3最适 pH 值多分布在 3.5-6.5[9]。一般 α-葡萄糖苷酶的稳定 pH 值范围超过 2 个 pH 值单 位[3]。多数 α-葡萄糖苷酶具有较高的最适温度和热稳定性，有利于其应用于工业领域。Piller 等[10]从一株嗜热性古细菌中分离的 α-葡萄糖苷酶的最适温度在 75 oC 左右。在 98℃条件下，其在缓冲液中的半衰期达 35 min，在添加 1%牛血清蛋白（BSA）和 1%二硫 苏糖醇（DTT）的条件下，该酶的半衰期可以提高到 215 min，通过固定化技术和特殊的化学修饰可以使该酶的稳定温度提高到 130 ℃。 氨基酸序列决定了蛋白的稳定性，α-葡萄糖苷酶的氨基酸组成是影响其热稳定性的重要因素。随着酶分子中疏水氨基酸成分的增加，稳定性增加。Degan 对枯草芽孢杆菌 中 α-葡萄糖苷酶氨基酸组成的研究显示，α-葡萄糖苷酶分子中亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸 和甘氨酸等疏水性氨基酸所占比例的增加有助于提高其热稳定性。这可能是由于疏水相 互作用的加强导致酶分子的结构更加紧密。α-葡萄糖苷酶可专一性地切开糖类底物分子中的 α-1,4 糖苷键，属于键专一性酶， 个别种类的 α-葡萄糖苷酶可以作用于蔗糖的 α-1,2 糖苷键。一般来说，α-葡萄糖苷酶具 有广泛的底物专一性，对底物要求不甚严格[1]。例如，蜜蜂 α-葡萄糖苷酶Ⅱ可作用于麦 芽二~七糖、异麦芽糖、蔗糖、松二糖、海藻糖、黑曲糖、苯基-α-麦芽糖苷、苯基-α-葡 萄糖苷、对硝基苯基-α-葡萄糖苷、环状糊精和可溶性淀粉等，最适作用底物为对硝基苯 基-α-葡萄糖苷和苯基-α-葡萄糖苷[11]。1.3 α-葡萄糖苷酶的来源α-葡萄糖苷酶种类繁多，在自然界广泛分布，几乎存在于所有生物体内，它在人类 的糖原降解和动物、植物、微生物的糖类代谢方面有着重要的功能。在动物肠道中有 α- 葡萄糖苷酶的分泌，用来帮助消化吸收麦芽糖和麦芽低聚糖。在微生物中，细菌、酵母、 霉菌等某些菌株能分泌 α-葡萄糖苷酶。已报道的能产此酶的菌种有曲霉，其中以黑曲霉 产酶量较高，以及乳酸菌，包括干酪乳杆菌、双歧杆菌等。1.4 α-葡萄糖苷酶在细胞中的分布α-葡萄糖苷酶有胞内酶与胞外酶之分。Yoshild 等[12]研究发现，甜菜细胞中具有与细 胞壁结合的