胞内段氨基酸序列对corin在细胞膜锚定及活化影响-effect of amino acid sequence of intracellular segment on that anchoring and activation of corin in cell membrane.docx

胞内段氨基酸序列对 c 胞内段氨基酸序列对 corin 在细胞膜锚定及活化的影响 中文摘要 中文摘要胞内段氨基酸序列对 中文摘要 胞内段氨基酸序列对 corin 在细胞膜锚定及活化的影响 I I PAGE PAGE VI 胞内段氨基酸序列对 corin 在细胞膜锚定及活化的影响 中文摘要 目的： Corin 是心脏中发现的一种 II 型跨膜丝氨酸蛋白酶（Type II Transmembrane Serine Protease，TTSP），通过氨基末端跨膜区域锚定在细胞膜上。与许多丝氨酸蛋白酶一 样，corin 以无活性酶原形式在核糖体中合成，经内质网、高尔基体，锚定在细胞膜 上，从而发挥其生物学功能。 现有文献报道，某些跨膜蛋白的胞内近膜区氨基酸序列在其细胞膜锚定与活化中 起重要作用。Corin 蛋白含有一个短的氨基端胞质尾部，有研究表明人 corin 蛋白氨基 端胞内段的“天冬氨酸-天冬氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺”（Asp-Asp-Asn-Asn，DDNN） 基序，可以影响 corin 蛋白在细胞膜的锚定和活化。但是，小鼠 corin 胞内段不含有 DDNN 基序，长短也不同于人 corin。因此，我们推断小鼠 corin 胞内段可能存在其它 的影响 corin 在细胞膜锚定与活化的序列。目前尚未有相关研究报道。 本课题中我们从胞内段近膜区的氨基酸序列和跨膜区胞内侧的电荷两方面，在国 内外率先开展工作，研究胞内段结构对小鼠 corin 在细胞膜的锚定与活化的影响，从 而阐明 corin 的结构与功能的关系，揭示 II 型跨膜丝氨酸蛋白酶在细胞膜锚定的机制。 方法： （1）以小鼠野生型 corin 质粒 mE1a 为模板，用 Vector NTI 软件设计引物，利用 PCR 定点突变技术（QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit）构建一系列 胞内段截短型 corin 表达载体及其它 corin 突变体。 （2）将野生型及突变 corin 质粒转染人胚肾（human embryonic kidney，HEK） 293 细胞，制备细胞裂解液，蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测重组 corin 蛋 白在细胞浆内的表达及活化情况。 （3）利用生物素标记细胞膜蛋白和流式细胞术检测截短型/突变体 corin 在细胞 膜表面的表达情况。 （4）将野生和突变 corin 表达质粒转染到 pro-ANP 稳定表达的 HEK293 细胞中， Western blotting 检测上清中的 pro-ANP 和 ANP，评估基因突变对 corin 功能的影响。 结果： （1）我们分别去掉胞内段 50 和 99 个氨基酸残基，构建小鼠截短型 corin mD50 和 mD99 表达载体。转染 HEK293 细胞，Western blotting 检测细胞裂解液中 corin 的 表达与活化，与野生型 corin mE1a 相比，mD50 对 corin 蛋白的表达和活化都没有影 响，mD99 对 corin 蛋白表达没有影响，但是，mD99 corin 蛋白的活化量显著增加（29.00 ± 0.32% vs. 12.48 ± 1.89%，p=0.0001，n=4）。我们还分别用生物素标记细胞表面蛋白 和流式细胞术检测 corin 在细胞膜的表达，发现 mD99 在细胞膜上的表达量显著增加。 结果提示：氨基端胞内段第 50 到第 99 个氨基酸之间存在抑制小鼠 corin 蛋白在细胞 表面表达和活化的序列。 （2）我们再分别去掉胞内段 60、70 和 75 个氨基酸，构建表达载体 mD60、mD70 和 mD75。转染 HEK293 细胞，Western blotting 检测 corin 的表达与活化，发现这些 突变不影响 corin 在细胞内的表达，但与野生型 corin mE1a 相比，mD75 的活化显著 增加（28.73 ± 0.01% vs. 16.63 ± 0.04%，p=0.02，n=3）。流式细胞术检测也发现转染 mD75 的 HEK293 细胞表面 corin 阳性率明显高于野生型 corin mE1a (76.34 ± 4.43% vs. 40.04 ± 5.10%，p=0.0017，n=4）。据此，我们推测抑制序列位于第 70 到第 75 个氨基 酸之间。 （3）基于上述结论，我们再从胞内段依次去掉 71、72、73 和 74 个氨基酸，构 建表达载体 mD71、mD72、mD73 和 mD74。转染 HEK293 细胞，Western blotting 检 测发现，与野生型 corin mE1a 相比，突变体在细胞内的表达未受影响，但 mD