产classⅱa类抗菌肽乳酸菌的筛选及其抗菌特性研究-screening of lactic acid bacteria producing class ⅱ a antimicrobial peptides and study on their antimicrobial properties.docxVIP

Classified Index: TS202.3U.D.C:Dissertation for the Master Degree in EngineeringSCREENING OF CLASSⅡ A BACTERIOCIN PRODUCING LACTICACID BACTERIA ANDANTIBACTERIAL PROPERTIES STUDYCandidate：Hou YawenSupervisor：Associate Prof.Yi HuaxiAcademic Degree Applied for：Master of EngineeringSpeciality：Food ScienceAffiliation：School of Food Science and EngineeringDate of Defence：June, 2013Degree-Conferring-Institution：Harbin Institute of Technology摘要随着消费者健康意识的增强和对食品安全问题关注的提高，食品防腐问题也 越来越受到人们的重视，目前食品工业上普遍使用的化学合成型的食品防腐剂对 人体健康产生不利的影响，从而使微生物型的防腐剂更加得到人们的青睐。乳酸 菌这类工业微生物代谢产生的抗菌肽因其无毒、安全的特点而成为国内外的研究 热点。本研究从实验室现有的大量乳酸菌资源中筛选出了产广谱、高效、特异性抗菌肽的菌株 Lactobacillus rhamnosus4121，并对其所产的 ClassⅡa 抗菌肽进行分 离纯化，优化了分离纯化参数；同时研究了不同酸碱处理、热处理、蛋白酶和化 学试剂作用对其抗菌肽抑菌活性的影响，为该抗菌肽在食品防腐方面的应用奠定了理论基础。本研究以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺杆菌、沙门氏菌以及单增李斯特菌等致病菌和食品腐败菌为指示菌，从实验室前期分离保藏的 91 株乳酸菌中筛选 出 5 株产抗菌肽乳酸菌，分别为菌株 3123、3222、3325、3521 和 4121。经 16SrDNA 分子生物学鉴定，其中 4 株为魏斯氏菌属，1 株鼠李糖乳杆菌，即 3123 为 Weissella hellenica NCFB 2973T；3222 和 3521 为 Weissella viridescens NRIC 1536T；3325 为 Weissella minor NRIC 1625T；4121 为 Lactobacillus rhamnosus JCM 1136T，其近缘性均在 99%以上。此外，根据Ⅱa 类乳酸菌抗菌肽保守序列设计引物（P1）BCgr2NSf：5’-ATGAAAAAGAAAKTAK TWAA-3’和引物（P2）BCgr2R1K：TTACAATAMASACCATTTCC，以这 5 株乳酸杆菌的总基因组为模版 PCR 扩增，结果发现均出现阳 性扩增条带，据此判断所产生的抗菌肽为 ClassⅡa 抗菌肽。结合抑菌谱、抑菌性强弱和 PCR 验证结果，选取菌株 4121 所产抗菌肽进行分 离纯化，分别采用细胞吸附解析法和 SP-Sepharose Fast Flow 阳离子交换层析法， 纯化过程中对阳离子交换层析参数进行最佳条件的确定。研究表明层析洗脱液用 含 0.1~1 mol/L NaCl 磷酸缓冲液（pH6.5）进行 3 步线性梯度洗脱，洗脱流速为 1 mL/min 的条件下，抗菌肽得率为 29.10%，纯化倍数为 27.46，最终比活力为 3695.15AU/mg。与之相比，细胞吸附解析法的抗菌肽得率为 40.80%，纯化倍数为 78.38，比活力为 10543.65 AU/mg。为进一步提高抗菌肽活力，设计了细胞吸附解析-阳离 子交换层析两步结合分离纯化法，最终使抗菌肽纯化倍数达到 91.99 倍。使该方法 可以成为菌株 4121 所 产 抗 菌 的 有 效 纯 化 手 段 。 将 纯 化 的 抗 菌 肽 进 行 Tricine-SDS电泳，发现该抗菌肽的分子量大小为 10KDa 左右，属于 ClassⅡa 抗菌肽分子量大小的范畴，进一步证明乳酸菌 4121 所产抗菌肽为 ClassⅡa 抗菌肽。研究菌株 4121 所产抗菌肽的抗菌特性发现，乳酸菌 4121 所产抗菌肽在 pH 2.0~8.0 的范围内均具有抑菌活性，在温度 20~120℃范围之间都具有较好的热稳定 性。不同蛋白酶的处理结果表明该抗菌肽对胃蛋白酶和胰蛋白酶并不敏感，而蛋白酶 K 和α -胰凝乳蛋白酶却可以使该抗菌肽失活。此外， Tween80 和 Tween20 对抗菌肽的抑菌活性没有显著影响，而无机盐 NaCl、蛋白酶抑制剂 EDTA 和去污 剂 SDS 在一定浓度条件下都能够显著降低抗菌肽的抑菌活