产木聚糖酶菌株ys1069的鉴定 产酶条件优化和酶学性质的研究-identification of xylanase-producing strain ys 1069 optimization of enzyme-producing conditions and study on enzymatic properties.docxVIP

上海海洋大上海海洋大学硕士学位论文万方数据万方数据上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注主席委员委员委员委员委员委员秘书答辩地点答辩日期产木聚糖酶菌株 YS1069 的鉴定、产酶条件优化和酶学性质的研究 摘 要木聚糖酶能够有效的水解木聚糖生成木寡糖，它在食品、饲料、造纸、医药 和环境保护等方面都有极大工业应用潜力和发展前景。本论文以酶工程课题组从 黄海海域中分离到的一株产木聚糖酶的菌株为研究对象，对菌株进行筛选纯化和 生理生化、分子生物学方面的鉴定以及发酵过程中培养基成分和培养条件的优化。 然后采用硫酸铵分级沉淀和超滤的方法对发酵粗酶液进行分离制备，再以制备的 木聚糖酶作为下一步的科研对象，对其酶学性质进行研究，以期为今后进一步的 科学研究和工业应用奠定理论基础。1. 本研究首先利用透明圈法初筛得到透明圈直径与菌落直径的比值较大的菌 株，然后通过摇瓶发酵复筛挑选出产酶能力较高的菌株，再通过连续传代培养并 发酵检测酶活观察菌株的遗传稳定性，最后筛选到一株遗传稳定且高产木聚糖酶 的菌株 YS1069，产酶活力达到 710 U/mL。然后通过观察菌株 YS1069 的形态学特 征，并分析其生理生化特征对其进行初步鉴定，结果显示：菌株 YS1069 的革兰氏 染色结果为阳性；有芽孢；菌落在营养琼脂培养基上呈圆形，突起，乳白色，表 面光滑，边缘规则，有粘性，易挑起，随着培养时间的增加，菌落边缘略微皱缩； 通过电子显微镜观察该菌为细长的杆状菌，长度约 2 μm，宽度约 0.5 μm。菌株 YS1069 耐盐性较好，在 5% NaCl 培养基中生长良好，14% NaCl 培养基中呈现弱 生长；最适生长 pH 范围为 9.0-11.5；生长温度范围较宽，在 20 ℃-45 ℃环境下都 可以较好的生长。再结合该菌的分子生物学鉴定结果，可初步确定产木聚糖酶的 菌株 YS1069 为芽孢杆菌属。2. 为了获得较高的木聚糖酶产量，采用单因素试验和响应面试验的方法，优 化菌株 YS1069 产酶的发酵培养基成分和发酵条件。首先，通过单因素实验筛选氮 源、碳源、无机盐、接种量、装液量、碳酸钠浓度、温度以及时间多个因素。试 验结果显示：当该菌产酶量最大时，各单因素成分的添加量分别为氮源豆饼粉 25g/L，碳源麸皮 40 g/L，无机盐 NaNO3 0.9 g/L、K2HPO4 3 g/L、MgSO4·7H2O 0.6 g/L，接种量 4%，碳酸钠浓度为 18 g/L，装液量 30 mL，培养温度 30 ℃，发酵时间为96 h。再通过 Plackett-Burman（PB）试验设计，对影响木聚糖酶产量的 8 个主要因素进行评价，确定了碳酸钠浓度、麸皮浓度和硫酸镁浓度是影响产酶量的 3 个I主要因素；利用中心组合试验设计（CCD）及 Design-Expert 8.05 软件分析获得了主要因素的最优条件，即碳酸钠浓度 21.86 g/L、麸皮浓度 51.41 g/L、硫酸镁浓度0.59 g/L。预测最高酶活力为 4462.34 U/mL，试验最终酶活达到 4408.63 U/mL，与未优化发酵条件前 738.21 U/mL 相比提高了近 5 倍，其试验值与预测值基本相符， 说明该预测模型可以应用于菌株 YS1069 发酵产木聚糖酶条件的优化。3. 采用硫酸铵分级沉淀和透析对发酵后的粗酶液进行初步分离制备，在 25 ℃条件下，加硫酸铵至饱和度 30%除去杂蛋白，上清液继续加入硫酸铵至饱和度 55%沉淀目标蛋白，将沉淀用 50 mmol/L pH 8.0 磷酸盐缓冲液复溶，置于 7 kDa 的透析 袋中透析；以 BaCl2 检测透析完全后，再用 10 kDa 的超滤膜对透析液进行超滤浓 缩，所得即为试验用初步分离制备酶液。以制备的木聚糖酶为研究对象，对其进行酶学性质的研究。结果表明：该酶 反应的最适温度是 60 ℃，反应的最适 pH 是 8.0；在 pH 8.0、温度 55 ℃下保温 1 h， 剩余酶活 84.88%，表明在该条件下木聚糖酶具有较好的稳定性；Ba2+、K+、Ca2+、 Mg2+、Al3+、Na+对该酶活性有促进作用，Li+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、 Fe3+对该酶活性有抑制作用，其中 Mn2+和 Li+抑制作用较明显。不同化学试剂对该 酶的作用结果显示：非离子型表面活性剂 Tween-60、TritonX-100 对该酶活力有激 活作用，Tween-20、Tween-40、Tween-80 对木聚糖酶酶活力有轻微的抑制作用。 阴离子表面活性剂（SDS）、非质子有机溶剂（DMSO）、阳离子表面活性剂（CTAB） 对木聚糖酶的抑制作用较明显。总之，初步酶学性质研究结果显示出它具有很好 的应用前景。