白藜芦醇对人髓母细胞瘤细胞中vdac1 calr表达的调节及其对肿瘤血管生成的影响-regulation of resveratrol on vda c1 calr expression in human medulloblastoma cells and its effect on tumor angiogenesis.docxVIP

目录一、摘要1(一)中文摘要1(二)英文摘要4二、正文7(一)前言(一)刖舌’77(二)材料和方法9(三)结果23(四)讨论34(五)结论38(六)参考文献39三、综述43(一)综述43(二)参考文献48四、致谢52万方数据大连医科大学硕士学位论文白藜芦醇对人髓母细胞瘤细胞中VDAOl、OALR表达的调节及其对肿瘤血管生成的影响硕士生姓名：胡月指导教师：王茜副教授指导小组：李宏教授专业名称：细胞生物学摘要研究背景：髓母细胞瘤(Medulloblastoma，MB)是儿童最频发的恶性脑肿瘤，常发于3．4和7．8岁的儿童。由于对MB发病的分子机制的研究尚不完善，目前对MB的治疗仍仅限于手术和药物辅助的放、化疗，但治疗效果并不理想。虽然有40％一60％的患者存活率在10年以上，但患者预后的身体和心理均产生严重创伤。故进一步明确MB发生的分子机制，寻求更为有效的靶向药物及其治疗靶点可为MB的临床治疗提供更坚实的理论基础。白藜芦醇(Resveratrol，RES)是一种普遍存在于葡萄、花生等70多种植物中的非黄酮多酚类化合物。它可以通过血脑屏障，具有抗肿瘤、抗心血管疾病、抗氧化、抗炎等多种生物学功能且无毒副作用。有研究发现白藜芦醇能够通过抑制肿瘤血管生成抑制肿瘤细胞的增殖。肿瘤血管生成(Tumorangiogenesis)在肿瘤发生和侵袭过程中具有关键作用，并受到血管生成因子和抑制因子的共同调节，其中一个关键的调节因子是血管生成因子(VEGF)，其在胃癌，乳腺癌，肝癌，髓母细胞瘤等多种肿瘤细胞中表达明显升高且与肿瘤恶性程度相关。钙网蛋白(calreticulin，CALR)是一种广泛存在的内质网钙结合蛋白，并具有高度保守性，它能够调节钙的平衡、协助折叠和加工蛋白质、提呈抗原、调节血管发生及调节细胞凋亡等多种生物学功能。CALR在白万方数据大连医科大学硕士学位论文血病、膀胱癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤中均有发现，有研究表明CALR在神经生长因子(NGF)诱导的神经母细胞瘤中明显上调，也先后有人通过蛋白质组学技术发现其在食管癌、乳腺癌中均有较高表达。电压依赖的阴离子选择性通道蛋白(Voltage—dependentanionchannel，VDACl)是一种主要通道蛋白，存在于线粒体外膜上。调节线粒体内外物质和能量代谢，参与细胞凋亡，抑制血管生成，其表达异常可使线粒体功能受到影响，与心脏病，卒中，肿瘤及神经变性疾病等有关。研究表明，胃癌细胞经幽门螺杆菌(H．pylori)处理后，VDAClmRNA和蛋白表达明显增加，并且多发性骨髓瘤细胞株(U266)经CD45处理后VDACl有高表达。目前，白藜芦醇对人髓母细胞瘤中CALR和VDACl的调节作用尚未见报道。目的：本研究旨在探究对白藜芦醇不同敏感性的人髓母细胞瘤细胞系UW228．3和DAOY中CALR和VDACl的表达的影响和生物学意义。1)探究白藜芦醇处理前后人髓母细胞瘤细胞系UW228．3和DAOY敏感性差异；2)检测白藜芦醇处理前后，上述两个细胞系中CALR和VDACl表达差异；3)比较分析UW228．3和DAOY对白藜芦醇的敏感性差异的原因；4)探究白藜芦醇抗肿瘤血管生成的分子机制，找寻抗肿瘤血管生成的药物作用靶点，为临床治疗髓母细胞瘤提供理论基础。方法：1)细胞培养：在含lo％胎牛血清的低糖DMEM和1640培养液中分别培养人髓母细胞瘤UW228．3和DAOY细胞；用100肛M白藜芦醇处理48h后收集细胞和细胞爬片；2)形态学检测：通过HE染色，MTT检测和流式细胞术观察并检测白藜芦醇处理前后细胞系UW228—3和DAOY形态学和细胞活性的改变；3)蛋白质组学：应用双向凝胶电泳技术比较白藜芦醇处理前后髓母细胞瘤细胞系UW228．3和DAOY中的蛋白质表达情况，利用质谱技术对差异蛋白进行鉴定分析，筛选潜在的抗肿瘤血管生成药物作用靶点；4)下游检测：通过IHC检测CALR和VDACl在人髓母细胞瘤组织阵列的表达情况并进行相关性分析；利用RT-PCR、ICC、IF和Western．blotting等方法检测白藜芦醇处理前后细胞系UW228．3和DAOY细胞中CALR和VDACl的表达情况。结果：1)HE染色、MTT检测和流式细胞术检测结果显示，髓母细胞瘤细胞系UW228．3在1009M白藜芦醇处理48小时后，细胞的数目明显减少而且细胞2万方数据大连医科大学硕士学位论文变细长，而DAOY的细胞数量与形态均未发生明显变化；2)双向电泳和质谱分析结果显示，白藜芦醇处理DAOY和UW228．3细胞后，CALR和VDACl均表达升高，其中DAOY细胞经100¨M白藜芦醇处理48h后CALR呈2．9倍上调，UW228—3中细胞的VDACl呈3．6倍上调；3)下游检测IHC结果显示，VDACl和CALR在