胞嘧啶脱氨酶自杀基因治疗大肠癌的实验分析-experimental analysis of cytosine deaminase suicide gene therapy for colorectal cancer.docx

本课题系南京医科大学创新基金资助课题(编号Cx9905)南京医科大学博士学位论文胞瞎啶月；f，氨酶自杀基因治疗大肠癌的实验研究中文摘要1含胞嘧啶脱．氨酶基因的靶向腺病毒栽体的构建及应用目的建立癌胚抗原(carcino-embryonicantigen，CEA)基因启动子驱动的含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(ECoh．cytosinedeaminase，EC—CD)自杀基因的重组腺病毒载体AdCEACD，研究CEA启动子控制EC-CD基因在CEA阳性的细胞中专一性表达并专一性杀伤的可行}生。方法采用同源重组法在293细胞中重组腺病毒，用点杂交、PCR法进行鉴定，用CsCl密度梯度超离心法纯化病毒，用空斑形成试验进行病毒滴度测定。以由巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子驱动EC．CD基因的重组腺病毒载体AdCMVCD为参照。体外分别感染CEA阳性(Lovo、HCTll16BG细胞)和CEA阴性(Hela、CT26细胞)细胞，用MT[法检蝴q受染细胞对5-氟目蠊啶(5-fluorocytosine，5-FC)的敏感性，并计算半数杀伤浓度(觚[ypercentinhibitionconcenvafion，IC50)；用RT-PCR法检测受染细胞EC．CD基因mRNA的表达。用Lovo、CT26细胞接种Balb／cnu／nu裸鼠皮下制成动物模型，瘤内接种病毒戴体，腹腔给予5-FC，治疗结束测量肿瘤体积：测定不同治疗组鼠外周血谷丙转萄酶与谷草转赏酶(趾J与AST)；并取鼠股骨骨髓涂片行瑞氏染色，观察骨髓增殖情况。结果鉴定显示重组腺病毒申含有CEA基因及EC-CD基因，纯化后滴度可以i盍到5．0×10”pftt／ml，CEA阴性的Hela、CT26细胞感染AdCMVCD后对5一FC敏感性增强，IC50明显降低(p0．01)，而感染AdCEACD后不能被5．FC杀伤；CEA阳性的Lovo、HCTlll6BG细胞感染AdCMVCD和AdCEACD后有相似的表达活性，均对5-FC敏感，IC50均明显降低(p0．01oAdCEACD／5-FC系统有明显的旁明者效应，当受染细胞比例仅为10％时，细胞存活率约为30％。RT-PCR检测显示Lovo细胞感染AdCEACD及AdCMVCD后均可检坝怛0EC-CDmRNA表述Hela细胞感染AdCMVCD后可以检测到EC-CDmRNA表达，但在AdCEACD感染后则没有EC-CDmRNA表达。在Lovo细胞裸鼠实验中，接种AdCMVCD或AdCEACD后，给予前药5-FC，肿瘤生长均明显抑制(po．01)；在CT26细胞稞鼠实验中，接种AdCMVCD并给予前药5-FC，肿瘤生长亦明显抑制(pO．01)，而在接种AdCEACD及给予5．FC后肿瘤生长没有明显影响。Lovo细胞裸鼠实验中单用5一Fc或单用AdCMVLacZ、AdCMVCD、AdCEACD等病毒对裸鼠√蝴、AST没有明显影响，但在同时给予5．F℃组，ALT、AST均有不同程度增加。Lovo细胞裸鼠实验申未处理纽及AdCEACD／5-FC治疗组骨髓增生明显活跃，而AdCMVCD／5，FC治疗组裸鼠骨髓增生活跃，与前两者相比骨髓增生明显受抑。结论本实验建立的CEA启动子驱动的含EC．CD自杀基因的腺病毒栽体AdCEACD，自酐吏EC-CD基因专一性地在CEA阳性细胞中表达，发挥专一性杀伤作用。与AdCMVCD比较，AdCEACD对动物骨髓有一定的保护作用。该载体基本达到实验设计要求，有助于实现对CEA阳性肿瘤的靶向性自杀基因治疗。2胞嘧啶Jl；f赢酶基因联合102、IN】脚：基因治疗大肠癌目的研究胞瞎啶Jljf凄酶基因(EC．CD)联合IL．2、矾F-Y基因对大肠癌的治疗作用。方法分别以重组腺病毒载体AdCMVCD、AdCEACD转导EC-CD基因；AdCMVIL-2转导人IL-2基因；AdCMVINF—Y转导鼠INF．Y基因。分另13在体外、内(Balb／cnu／nu裸鼠及Balb／c小鼠)研究EC-CD基因联合^IL-2基因对Lovo细胞肿瘤、以及EC-CD基因联合鼠INF-v基因对CT26细胞肿瘤的治疗作用。体内联合治疗结束后取肿瘤行常规．HE染色进行纽织学检查。结果Lovo细胞和CT26细胞分别受AdCMVIL-2、AdCMVIFN-Y感染后细胞生长受到比较明显抑制。联合AdCMVINF．v可以增强AdCMVCD／5-FC对CT26细胞的杀伤作用，IC50明显变小(p=0．001)，肿瘤生长明显抑制(tr=0．000)。联合AdCMVIL-2亦增强AdCEACD／5．FC对Lovo细胞的细胞毒作用(p=0．051)，肿瘤生长亦明显抑制(p=o．000)，联合治疗的效果与单用AdCMVCD／5-FC接近。组织学检查显示EC-CD基因