本地毛形线虫49ku es蛋白结构基因的分子克隆及原核表达-molecular cloning and prokaryotic expression of 49ku es protein structural gene of local trichogramma.docxVIP

摘要摘要旋毛虫ES(Excretory．Secretory，ES)蛋白，即旋毛虫生长过程中的排泄分泌产物。 作为检测抗原，它具有灵敏度高和特异性强等特点；作为免疫原，它可以诱导动物产生较 强的免疫保护力，因此具有双重的免疫学功能。同时其编码基因在旋毛虫分类上也具有重 要意义。但由于Es蛋白制各困难而限制了它的研究和利用，针对这一问题，本实验用重 组DNA技术从本地毛形线虫[Trichinella nativa(tnativa，T2)】中分得49ku抗原的编码 基因并进一步进行克隆、表达及检测。本实验通过对t nativa肌幼虫收集后的体外培养及ES蛋白抗原性的分析，确定了旋毛虫Es抗原可以引发较强的特异性免疫反应。，根据学者Su XZ发表的编码旋毛形线虫[Triehinella spiralis(T spiralis，T1)]49ku蛋 白的基因结构，设计并合成了一对PCR引物。直接加Tfizol研磨裂解虫体，用RNA提取 试剂盒来提取i2 nativa的总RNA，再经紫外分光光度计测定样品总RNA含量后，用反转 录PCR(ReverseTranscfiption·polymeraseChainReaction，RT-PCR)方法扩增出了t nativa 的目的基因TNPG。将PCR产物与pMDl8．T载体连接并经过大肠杆菌增殖后送检测序。 序列分析结果表明：扩增出的目的基因TNPG长度为951bp，核苷酸序列同已发表的一 spiralis的序列P49有一定的差异，经同源性分析，二者核苷酸序列同源性为98．63％，推 导其所编码氨基酸序列同源性为99．05％。从克隆载体上切下目的基因后，将之插入到原核表达质粒pET．30a的BamH I酶切位 点处，将重组原核表达质粒pET-30a-TNPG转化到BL．2I感受态表达菌中。经IPTG诱导 表达，超声波裂解处理表达菌后，用SDS．PAGE分析表达产物。结果表明：TNPG在原核 表达菌BL·21中获得了高效表达，表达产物为40．8ku的融合蛋白。表达量达到菌体总蛋白 的22．8％。＼一通过Westernblot分析，证明其表达产物可以被小鼠一nativa阳性血清特异性识别^蚣己本实验研究结果揭示：本地毛形线虫(Trichinella nativa)49ku ES蛋白编码基因序列 的研究在旋毛虫分类上具有重要意义；在大肠杆菌中表达的丁．natJva 49ku重组蛋白，是研 制旋毛虫基因重组抗原良好的侯选蛋白，其在旋毛虫病的检测和免疫方面具有潜在的开发 和应用价值。关键词本地毛形线虫：Es蛋白：结构基因趣圃1VCloning and Prokaryotic Expression ofa Fraction Structural Protein for Trichinella nativaAbstractThe ES protein of Trichinella nativa(T,nativa,T2)is the Excretory-Secretory products of their living worms．As a detectable antigen of naturally infected animal，ES protein has been proved to have very high levels of sensitivity and specificity．While∞all immunogen．it caninduce a strong immunologocal protection to animals．At the same time，the encoding gene of the ES protein has the important application in classification of Trichinella．However,the extensive study and large．scale application of ES protein are restricted because of its difficult preparation．Therefore．it is possible t0 prepare for the specific recombinant antigen if only we Carl acquire the specific genes encoding for T nailva,and we expect to clone and express the gene encoding for the 49 ku antigen in this report．We cultured t nativ