固本健脑法对ad细胞模型的作用及caveolin-1 p-tau影响的研究-study on the effect of the method of strengthening brain by consolidating foundation on ad cell model and the effect of cave olin - 1 p - tau.docx

中文摘要目的伴随社会老龄化问题日益加剧，阿尔茨海默病（AD）已成为全世界共 同关注的议题，其患病率、发病率的上升与年龄的增长成指数关系，而其 高患病率不仅影响患者的生理、心理和经济，并且也影响医护人员、患者 的家属与朋友、医疗卫生体系和整个社会。因此，加强研究 AD 的病因、发病机制，探索有效的防治方法与药物，有着非常重要的临床价值和现实 意义。本课题旨在论述 AD 基本病因病机的基础上，探讨 AD 的治则治法， 并在成功分离、培养海马神经元，构建 pEGFP-C1-CAV1 质粒、CAV1-shRNA 慢病毒，建立目前公认的 AD 体外模型基础上，观察固本健脑法治疗 AD 的作用及机制，为中医药治疗 AD 的深入研究提供理论基础和实验依据。 方法（1）通过分离新生鼠大脑，解剖其海马，分离、培养海马神经元生长，进行形态学观察，并用 MAP-2、Tau 作为神经元的标记，对培养的海 马神经元进行免疫荧光及免疫印迹鉴定。（2）设计带酶切位点及保护碱基 的引物，摸索 CAV-1 PCR 反应的退火温度；将 pEGFP-C1 载体及 CAV-1 基 因用 EcoRⅠ、SalⅠ双酶切，其酶切产物进行电泳鉴定并回收；将其鉴定 阳性的 CAV-1 基因与线性载体进行 T4 连接酶连接，及 DH5a 感受态过夜转 化，小量提取重组质粒，并双酶切及电泳鉴定，将电泳鉴定阳性的质粒进 行测序验证；扩大培养测序正确的含质粒的细菌并保留菌种，再大量提取（去内毒素）重组质粒，并检测其浓度，最后进行海马神经元转染预实验。（3）设计 CAV-1 的 shRNA 靶点序列和针对 CAV-1 的 2 对干扰寡核苷酸序 列，在 RNA 干扰正义链和反义链中均以 Loop 结构相连形成发卡状结构， 构建含有 GFP 报告基因的 CAV1 基因 shRNA 慢病毒载体，并通过测序进行 鉴定；用构建好的 shRNA-CAV1 慢病毒感染 293T 细胞，感染 72h 后根据各 组表达 GFP 荧光的数目及稀释倍数，计算病毒滴度，并进行海马神经元感染预实验。（4）制备含药血清，用 MTT 法测不同浓度含药血清对细胞的影响；Aβ1-42 溶于无菌三蒸水稀释，使其终浓度为 2.5mmol/L，37℃孵育 3d，IIIII制成聚集状态的 Aβ1-42，诱导大鼠海马神经元，根据不同诱导时间点神经元的存活率、细胞形态及 p-Tau 蛋白表达水平，选择最佳诱导时长。（5） 用构建成功的 CAV1-shRNA 慢病毒感染正常海马神经元，以沉默 CAV-1 基 因；用构建成功的 pEGFP-C1-CAV1 质粒转染正常海马神经元，以过表达 CAV-1 基因；用含药血清进行干预。经 Western blot 定量分析 CAV-1、 GSK-3β、p-Tau 水平，用以判断/证实 CAV-1 蛋白在调节 GSK-3β、p-Tau 水平是关键因素。（6）用构建成功的 pEGFP-C1-CAV1 质粒转染海马神经元， 以过表达 CAV-1 基因；用 Aβ1-42 诱导海马神经元，建立 AD 细胞模型；用 含药血清进行干预。经显微镜下观察细胞形态及荧光、Western blot 定 量分析 CAV-1、GSK-3β、p-Tau 水平，用以探讨固本健脑法对 Tau 蛋白过 度磷酸化的影响。结果1.新生大鼠海马神经元的原代培养神经元形态学观察：培养 4 小时后，刚贴壁的细胞圆而透明，折光性 好，胞体较大的细胞约占胞体较小细胞的 1/3，分布均匀。第 1 天，能见 少数胞体较大的细胞有突起生成。第 2 天，约 1/3 细胞见突起增多。第 3天，见细胞胞体增大较快且长突起的细胞数目也有所增加。第 4 天，神经元突起进一步增多并延长，初步形成稀疏的网状。第 5 天，神经元胞体逐渐增大，胞突主干和分枝明显延长并增粗，形成更加稠密的网络。第 7 天，细胞稍有聚集，细胞突起长度明显增长，形成较为完整的网络。2.海马神经元的鉴定 免疫荧光鉴定结果：荧光显微镜下的绿色荧光即为海马神经元树突，红色荧光即为海马神经元轴突，二者的叠加图即为海马神经元的突起（树 突与轴突）。免疫印迹鉴定结果：第 1 天时由于细胞较少，只有少量神经 元有突起，故 MAP-2、Tau 蛋白的表达量均很少；第 3 天神经元树突、轴 突的数量有所增加，则 MAP-2、Tau 蛋白的表达量有所上升；第 5 天树突、 轴突延长并增粗，形成网络，因此 MAP-2、Tau 的表达量已经较多。pEGFP-C1-CAV1 质粒构建与表达IIIIII重组质粒单向测序结果与 NCBI 的 Gene Bank 上大鼠 CAV-1 基因序列BLAST 同源性达 100%，且酶切位点前后与质粒载体序列一致，无碱基突变、 缺失，证实了构建质粒的正确性。用质粒与脂质体