胱硫醚γ裂解酶硫化氢通路失调在氧化低密度脂蛋白诱导巨噬细胞炎症中作用-role of imbalance of cystathionine gamma lyase hydrogen sulfide pathway in inflammation of macrophage induced by oxidized low density lipoprotein.docxVIP

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2018-07-05 发布于上海
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胱硫醚γ裂解酶硫化氢通路失调在氧化低密度脂蛋白诱导巨噬细胞炎症中作用-role of imbalance of cystathionine gamma lyase hydrogen sulfide pathway in inflammation of macrophage induced by oxidized low density lipoprotein

胱硫醚胱硫醚 γ 裂解酶/硫化氢通路失调在氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞炎症中的作用中文摘要 PAGE PAGE III PAGE PAGE VI中文摘要目的：研究胱硫醚γ 裂解酶（Cystathionine γ-lyase，CSE）/硫化氢（Hydrogen sulfide, H2S）通路在氧化低密度脂蛋白（Oxidized LDL，ox-LDL）诱导的巨噬细胞炎症中的作用，并探讨其相关机制。方法：以 Raw264.7 细胞和小鼠原代腹腔巨噬细胞为研究对象，采用 ox-LDL 建立细胞炎症模型。采用逆转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）及 Western blot法检测胱硫醚-γ -裂解酶（Cystathionine γ-lyase，CSE）的转录及表达变化；采用亚甲蓝法检测细胞外HS-浓度变化；采用瞬时转染技术构建CSE过表达及基因敲减的细胞模型；运用不同的CSE抑制剂为工具药抑制CSE活性；ELISA检测炎症相关因子肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）及细胞间粘附分子（Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的生成和释放；采用粘附实验检测巨噬细胞与内皮细胞间的粘附；采用Western blot法检测IκBα及磷酸化IκBα的表达、免疫荧光方法检测NF-κB亚单位p65的亚细胞定位分布，结合ELISA法检测胞核中NF-κB的转录活性；采用Western blot的方法检测JNK、ERK、P38的磷酸化水平。结果RT-PCR结果显示正常培养条件下Raw264.7细胞仅表达CSE，而不表达胱硫醚- β -合成酶（cystathionine-β -synthase，CBS）。Western blot 和RT-PCR结果显示：与对照组相比，ox-LDL组CSE蛋白水平及mRNA水平均降低（p0.05），且亚甲蓝法检测细胞外HS- 浓度变化结果显示 ox-LDL 作用后，原代小鼠腹腔巨噬细胞及 Raw264.7细胞胞外HS-浓度降低，提示ox-LDL抑制巨噬细胞CSE表达及H2S生成；利用瞬时转染技术构建过表达及敲减CSE，结果发现与转染载体组相比，CSE过表达组ox-LDL诱导的Raw264.7细胞TNF-α产生显著减少（P0.01），而CSE敲减则使 TNF-α产生明显升高（P0.05）；而用不同的H2S供体NaHS和Na2S预处理，发现与中文摘要胱硫醚 γ 裂解酶/硫化氢通路失调在氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞炎症中的作用 ox-LDL组相比，预处理组TNF-α产生显著降低，原代细胞结果也与此一致；NaHS 预处理组ICAM-1生成和释放亦减少；粘附实验结果表明NaHS预处理组巨噬细胞与内皮细胞间的粘附数减少；与H2S供体作用相类似，H2S合成底物cysteine预处理亦可显著降低TNF-α生成，且该作用能被CSE抑制剂PAG和BCA逆转；Western blot 及免疫荧光结果显示，ox-LDL能够促进IκBα、ERK及JNK磷酸化（P0.01），并明显促使p65向细胞核内转位，而NaHS和Na2S能够抑制IκBα及JNK磷酸化（P0.05），且减少巨噬细胞核内的p65水平。另外，RT-PCR结果显示NF-κB、ERK、JNK抑制剂均可部分逆转ox-LDL引起的CSE转录下调；ELISA结果显示JNK抑制剂能明显抑制ox-LDL诱导的NF-κB转录活性增加。结论：CSE/H2S 通路在 ox-LDL 诱导的巨噬细胞炎症模型中发挥重要的抗炎作用， ox-LDL 可通过抑制 JNK/NF-κB 通路而减少 CSE/H2S 表达，从而加剧炎症发生。本研究可能为动脉粥样硬化治疗提供一个新的靶点。关键词：ox-LDL ；CSE；硫化氢； JNK；炎症； Raw264.7作者：王贤慧指导教师：刘春风胡丽芳胱硫醚胱硫醚 γ 裂解酶/硫化氢通路失调在氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞炎症中的作用英文摘要 PAGE PAGE V PAGE PAGE VIDysregulation of cystathionine γ-lyase (CSE)/hydrogen sulfide pathway contributes to ox-LDL-induced inflammation in macrophageObjective:AbstractTo investigate whether CSE/H2S pathway was involved in ox-LDL-triggered infla