骨髓微环境介导急性髓系白血病细胞化疗耐药及机制分析-analysis of drug resistance and mechanism of bone marrow microenvironment-mediated chemotherapy in acute myeloid leukemia cells.docxVIP

华 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 PAGE 10 PAGE 10前 言肿瘤微环境的概念已经逐渐被学术界广泛接受，肿瘤微环境对于肿瘤的发生、发展、 治疗及转归都有重要的影响。肿瘤相关间质是肿瘤微环境的主要组成部分，其包括有 肿瘤相关纤维细胞（CAF）、内皮细胞、周细胞、炎症和免疫细胞等，其中肿瘤相关 的纤维细胞、肿瘤相关的 T 细胞、巨噬细胞正日益成为肿瘤研究的热点。肿瘤细胞与肿瘤间质之间的相互作用直接影响着肿瘤的发生、发展及预后，现在 还不清楚在肿瘤发生早期是先出现肿瘤细胞还是先有肿瘤细胞合适生存的肿瘤微环 境（1），但已有研究表明正常的间质细胞能抑制肿瘤细胞的生长和肿瘤的发生，而异 常的肿瘤间质可以诱发某些肿瘤的出现。越来越多的研究表明活化的肿瘤间质细胞可 以通过分泌各种各样的细胞因子、细胞外基质蛋白等与肿瘤细胞相互作用促进肿瘤的 生长、侵袭、转移、耐药、复发等生物学行为(2)。在将来，肿瘤的治疗必然将随着对 肿瘤微环境的深入研究而发生改变，肿瘤间质将是肿瘤治疗新的关注领域。当今，肿瘤的发生依旧呈上升趋势，肿瘤的治疗仍然是人类面临最棘手的医学问 题之一。在肿瘤治疗日益多样化的今天，肿瘤的化疗仍然是最主要的治疗方法之一， 虽然对某些肿瘤或特定时期的肿瘤效果很好，但是化疗耐药的出现一直是困扰提高化 疗疗效的主要瓶颈。肿瘤发生化疗耐药的原因很多，主要包括药理性、生化代谢性、 微环境性耐药等，其中肿瘤微环境与耐药的关系越来越受到重视。肿瘤细胞在化疗的 情况下能利用肿瘤微环境即肿瘤间质细胞所分泌的各种有助于肿瘤细胞存活的细胞 因子、细胞外基质蛋白等信号而改变自身的某些生存状态，发生耐药、抗凋亡(3)。造血干细胞移植虽然对某些白血病的治疗效果有很大的改善，但白血病的化疗及 化疗耐药仍然是在临床工作中面临的主要问题之一。骨髓的微环境对与维持骨髓造 血、干细胞的特性、骨与破骨细胞的平衡等方面有重要的作用(4 16)，同时与白血病的 发生、发展、预后都有密切的关系。骨髓微环境主要包括骨髓基质细胞（Bone marrow stroma cell）BMSC 、内皮细胞、破骨与骨细胞、细胞外基质蛋白等，有研究表明在 血液肿瘤中骨髓微环境发生改变，特别是 MSC 细胞存在异常(5)。而在白血病化疗时， 骨髓中残余的白血病细胞可能是白血病复发的根源，骨髓基质细胞可能参与了血液肿瘤细胞化疗后残余细胞的耐药过程，各种细胞因子比如 IL-6、SDF-1/CXCR4、FGF 、VEGF、与整合素相关的因子等可能都有助于白血病细胞的存活，为其提供了生存信 号和避难场所（6-11）。更好的了解骨髓微环境在白血病化疗耐药中的作用将有可能改 进白血病的治疗。材料与方法一、 实验材料1. 细胞系与细胞培养：人早幼粒白血病细胞 HL-60 为本实验室库存，购自美国典型生物物种保藏中心（ATCC），细胞快速复苏后用含 10％胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素 的 RPMI1640 培养基培养。骨髓间充质干细胞 MSC 来源于同济医院血液科门诊和住 院病房的正常的和确诊为急性髓系白血病病人的标本，通过分离鉴定得到。骨髓间充 质干细胞用含有 20%的 Gibco 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素的 a-MEM 培养基培养。两种细胞均在 37℃、5％CO2 饱和湿度条件下培养，MSC 细胞生长融合 度达到 90%时用 Gibco 公司胰酶替代物 TrypLE Express 消化传代。2. 实验所用试剂：RPMI1640 培养基、a-MEM 培养基粉购自 Gibco 公司，本实验室自行配制、调 PH 值、过滤；普通胎牛血清购自杭州四季清生物工程公司；养 MSC 用胎牛血清、胰酶 替代物 TrypLE Express 均购自 Gibco 公司；Ficoll-10771 分离液购自 Sigma 公司；直 标荧光抗体：PE 标记同型 IgG、CD90、CD44、CD105 和 FITC 标记同型 IgG、CD19、 CD34、CD45 均购自 Biolegend 公司；Annexin-Ⅴ-FITC/PI 凋亡检测试剂盒购于江苏南 京凯基生物科技发展有限公司；染周期用 PI 购自 Sigma 公司；AP 标兔、鼠二抗购自 Jackson ImmuoResearch 公司；β-actin 兔单克隆抗体购于 Santa Cruz 公司；P-AKT（Ser473）兔单克隆抗体、P-P38 兔单克隆抗体、Bcl-2 鼠单克隆抗体均购自 Cell signaling 公司、ILK 兔单克隆抗体、ASK 兔单克隆抗体、Survivin 兔单克隆抗体均购 自 Epitomics 公司；纤维连接蛋白 FN 购自 BD 公司