骨形成蛋白-4在急、慢性气道炎症中的表达改变及功能-expression and function of bone morphogenetic protein - 4 in acute and chronic airway inflammation.docx

广州广州医学院硕士学位论文 骨形成蛋白-4 在急、慢性气道炎症中的表达改变及功能 PAGE PAGE 2rpmrotation per minute每分钟转速TEMEDtetramethylethylenediamine四甲基乙二胺EDTAethylene diamine tetraacetic acid乙二胺四乙酸CPMcount per minute每分钟的脉冲计数LIlung injury肺损伤骨形成蛋白-4 在急、慢性气道炎症中的表达改变及功能硕士研究生：李征途导 师：王健 教授 指 导老 师：卢文菊 教授中文摘要【研究背景】： 炎症反应是拥有循环系统的真核生物体针对内源性或外源性有害刺激的一种综合防御反应的总称，这些有害刺激物包括病原体、自身受损细胞和其他刺 激物。这是机体尝试清除这些有害刺激，清除和吸收坏死组织和细胞并进行损 伤修复的过程，属于天然免疫的范畴。但过度的炎症反应会导致机体损伤。肺 部炎症反应的失调会引起肺血管渗透性增加，炎症细胞肺侵润增加，虽然这样 可以增强肺泡对外来细菌的清除能力，但也同时引起肺损伤（LI）。慢性气道炎症是 COPD 发病的核心内容，其形成机制十分复杂，涉及多种 炎性细胞。在 COPD 模型小鼠肺的不同部位均发现肺泡巨噬细胞、T 淋巴细胞 和中性粒细胞增加。现有证据表明香烟或污染空气中的有害物质刺激气道上皮 细胞、肺泡巨噬细胞等释放大量炎症因子如 TNF-α、IL-8、蛋白酶类等，这些介 质能促进中性粒细胞炎症反应和(或)破坏气道和肺组织结构，造成慢性气道炎 症。TGF-β的家族和人类的多种疾病有关，如肿瘤、炎症、组织纤维化等。在 这些疾病中，TGF-β呈现出不同的细胞功能，其中包括 TGF-β在炎症过程中 的抗炎作用。研究发现在 OVA 引起的过敏性气道炎症中，TGF-β的信号通路 是活跃的。另外有研究发现 TGF-β1 参与了气道炎症疾病，如慢性鼻窦炎、哮 喘、慢性阻塞性肺疾病等，的炎症和气道重构的发病过程，参与了炎症的免疫 调节和纤维增生调节。在炎症的发病过程中，TGF-β1 通过 smad 和非 smad 通路调节多种细胞的功能，如 Th2、Th17，特别是 Treg 细胞，从而抑制 T 细胞的活性，下调炎症的反应。骨形成蛋白-4（BMP4）是一种分泌型蛋白，在结构上属于 TGF-β家族的 成员，在调节胚胎期肺组织的成长和气管支气管的分化中起重要的作用。在成 人，有研究证明 BMP4 在冠状动脉粥样硬化发病中起促进炎症发病的作用。原 位杂交试验表明，在成人的气道 BMP4 表达于上皮细胞、气道粘膜下层细胞以 及炎症细胞聚集处。但另有研究发现 BMP4 在成人哮喘病人的过敏性气道炎症 中表达基本无变化，随后的研究发现 BMP4 能促进间叶细胞和气道上皮细胞间 的转化，在 1-NN 导致的肺炎症损伤模型中有利于机体抵抗炎症造成的损伤， 并能增加气道上皮细胞的迁移能力，有利于炎症损伤的修复；BMP4 在肺动脉 高压发病中具有促进肺血管重构的作用。但目前关于 BMP4 在急性气道炎症以 及 COPD 发生发展中的作用还不清楚。【研究目的】：本论文研究探讨骨形成蛋白-4（Bone Morphogenetic Protein 4，BMP4）在 脂多糖（LPS）诱导的急性气道炎症中的表达改变及功能；探讨 BMP4 在香烟 烟雾诱导的慢性气道炎症过程中的表达改变及功能。【研究方法】：1、动物实验：①、LPS（7.5μg/50μl 生理盐水）或者生理盐水（正常对 照组）滴鼻处理 C57 小鼠。处理后于不同时间点处死小鼠，取支气管肺泡灌洗 液（BAL fluid），统计其中细胞总数和分类细胞数，并用 ELISA 方法检测其中 TNF-a、KC 等炎症因子的水平。用蛋白免疫印迹技术检测肺组织总蛋白中 BMP4 的蛋白水平。同时观察经 HE 染色的肺组织病理切片中炎症以及肺组织损 伤情况。②、LPS（7.5μg/50μl 生理盐水）滴鼻处理 BMP4 野生型（BMP4+/+） 和基因半敲除小鼠（BMP4+/-），48 小时后处死小鼠，并比较两组小鼠以下参数 的差异：支气管肺泡灌洗液中细胞总数及分类细胞类型及数量、支气管肺泡灌 洗液中 TNF-a 和 KC 水平、肺组织中 BMP4 蛋白水平及肺部炎症和肺组织损伤 情况。③、铜绿假单胞菌（PA）（1×105 或者 1×106 CFU/小鼠，5 只/组）滴鼻感染 BMP4+/+和 BMP4+/-小鼠，12 小时后观察小鼠肺中 PA 的清除率。④、香烟 烟雾诱导的方法建立慢性气道炎症模型（COPD 模型），观察模型的肺功能改变， 支气管肺泡灌洗液中炎症细胞的分类计数，ELISA 方法检测支气管肺泡灌洗液 中 KC 和肺组织中 Muc5AC 水