纤维素酶转化朝藿定B制备箭藿苷B研究.docVIP

纤维素酶转化朝藿定B制备箭藿苷B研究 　　[摘要]该实验采用纤维素酶水解朝藿定B以制备箭藿苷B。以转化率为指标，通过单因素考察pH、温度、反应时间、酶用量、底物的浓度对转化率的影响，L9（34）正交试验优化制备工艺；采用MS，1H-NMR，13C-NMR鉴定水解产物。结果表明，酶解反应的最适条件为温度50 ℃，反应介质（pH 5.6）醋酸-醋酸钠缓冲液，底物质量浓度20 g?L-1，酶与底物质量比3∶5，反应时间24 h，反应产物相对分子质量646.23，核磁图谱证实产物为箭藿苷B。该工艺简单可靠，反应条件温和，适合工业化生产。 　　[关键词]箭藿苷B；朝藿定B；纤维素酶；生物转化 　　[收稿日期]2013-06-25 　　[基金项目]国家自然科学基金项目3097394481303275） 　　[通信作者]*贾晓斌，博士生导师，Tel：（025）E-mail：jxiaobin2005@ 　　[作者简介]徐凤娟，硕士研究生，TelE-mail：yx0702fjx@163.com 　　箭藿苷B是小檗科淫羊藿Epimedium brevicornum中的一种多羟基黄酮类成分。有关箭藿苷B的文献报道大多集中于提取分离和检测2个方面[1-8]。箭藿苷B在淫羊藿药材中含量低，直接从药材中提取分离，不仅所需时间长，步骤繁琐，而且试剂消耗大，产量也较低。而酶解反应具有选择性高，反应条件温和，产物完整，转化率高，分离纯化容易，对环境无污染及成本低廉等优点[9]。纤维素酶是一组由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶组成的混合酶[10]，可选择性的切断朝藿定B中β-D-葡萄糖糖苷键。本实验研究了纤维素酶水解朝藿定B制备箭藿苷B的工艺，为其工业化生产提供参考。 　　1材料 　　高效液相色谱仪（Waters，600型泵，717自动进样器，Empower数据处理系统）；自动纯化系统（Waters 2489 紫外-可见光检测器，Waters 2767 进样阀，Waters 2545 二元梯度泵，Waters 515 高效液相泵，Waters 3100质谱仪）；数显气浴恒温振荡器（金坛市双捷实验仪器厂）；瑞士Bruker（AV 300）核磁共振仪，溶剂为氘代二甲基亚砜（DMSO）。 　　朝藿定B （自制，纯度98%） ；箭藿苷B （自制，纯度98%）；纤维素酶（夏盛实业集团有限公司，酶活力50～100万 U?g-1）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。 　　2方法与结果 　　2.1箭藿苷B的制备工艺 　　称取朝藿定B 100 mg及适量的纤维素酶加入醋酸-醋酸钠缓冲液10 mL，于实验条件下反应一定时间，将转化后的混悬液离心，弃去上清液，沉淀用10倍量高纯水洗3次，再用无水乙醇溶解，滤过，滤液水浴挥干，即得箭藿苷B。 　　2.2箭藿苷B转化率的测定 　　2.2.1色谱条件Luna-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～29 min，25% A；29～30 min，25%～41% A；30～55 min，41% A；55～60 min，41%～25% A；60～65 min，25% A。检测波长270 nm；流速1.0 mL?min-1；柱温30 ℃；进样量20 μL。色谱图见图1。 　　2.2.2对照品溶液的制备取箭藿苷B 10.38 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加无水乙醇至刻度，即得1.038 g?L-1箭藿苷B对照品储备液。 　　2.2.3供试品溶液的制备精密量取转化后的混悬液0.2 mL置于10 mL量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。 　　2.2.4线性关系考察精密量取箭藿苷B储备液，加无水乙醇稀释成166.08，83.04，41.52，20.76，10.38 mg?L-1对照品溶液，进样测定。以质量浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归。得回归方程A=34 181C-21 845，R2=1，线性范围10.38～166.08 mg?L-1。 　　1. 朝藿定B；2. 箭藿苷B。 　　图1对照品（A）和样品（B）的色谱图 　　Fig.1Chromatograms of reference substance（A） and sample solution（B） 　　2.2.5精密度试验精密吸取箭藿苷B对照品溶液20 μL，重复进样6次，分别测定箭藿苷B的峰面积值，RSD 0.030%，表明精密度良好。 　　2.2.6稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h时进样测定，RSD 1.2%，表明供试品溶液至少在