硫磺熏蒸金银花中断马钱子酸亚硫酸衍生物产生机制探讨.docVIP

硫磺熏蒸金银花中断马钱子酸亚硫酸衍生物产生机制探讨 　　[摘要]为了探讨硫磺熏蒸金银花中断马钱子酸亚硫酸衍生物的生成机制，该研究采用柱色谱技术从未硫熏金银花中目标性制备分离了断马钱子酸以进行后续模拟反应，断马钱子酸在有水条件下与二氧化硫反应生成了其亚硫酸衍生物，反应机制可能涉及了断马钱子酸的酯化反应或者是酸化开环后亚硫酸根对羰基的加成反应。该研究为支持硫磺熏蒸导致金银花中断马钱子酸转变成其亚硫酸衍生物提供了实验依据。 　　[关键词]硫磺熏蒸；金银花；断马钱子酸 　　金银花为常用大宗中药材，来源于忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb. 的干燥花蕾或待初开的花，自1963年为历版《中国药典》所收载。金银花具有清热解毒，疏散风热之功效，用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热等[1]。其化学成分包括挥发油、酚酸（主要为绿原酸及其衍生物）、环烯醚萜（断马钱子酸、马钱苷、当药苷及其衍生物）和黄酮类（芦丁、木犀草苷等）。现代药理研究表明金银花具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力、解热抗炎和利胆保肝等作用[2]。传统的产地加工方法有晒干和阴干，现代加工方法有烘干、水蒸气干燥、热风干燥以及热风-微波联用等，1995年版《中国药典》曾收载过硫磺熏蒸的处理方法，在2000年版之后的《中国药典》均取缔了该产地加工方法，然而，在某些主产区，有时仍会采用硫磺熏蒸以获得良好的外观色泽和防止虫蛀。前期研究表明硫磺熏蒸能够导致金银花中环烯醚萜类主成分断马钱子酸1的含量降低，同时生成其亚硫酸衍生物2～4[3]，见图1。断马钱子酸是一种分子结构中具有半缩醛羟基的环烯醚萜类成分，为金银花含有的环烯醚萜类物质中的主要成分[4]，含量远远高于马钱苷和当药苷及其二聚产物，其含量的变化有可能会引起金银花与环烯醚萜类成分相关的药理活性的改变，譬如抗炎、抗病毒、保肝利胆等。为了进一步验证硫熏金银花中断马钱子酸亚硫酸衍生物的生成机制，该研究采用柱色谱技术从未熏金银花中目标性制备断马钱子酸作为反应底物，将其在有水条件下与SO2反应，TLC和HPLC监测反应进程，基于LC-MS提供的质谱信息，与文献数据比对，鉴定生成的化合物结构。 　　1材料 　　Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津）、Agilent 1200-6130系列液相色谱-质谱联用仪（Agilent Technologies）、大容量冷冻离心机（DL-6MB， 长沙英泰仪器有限责任公司）、SIGMA 1-14小型离心机（Germany）、EYELA N-1100旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）、裕华HH-S型水浴锅（巩义市裕华仪器有限责任公司），HZ85-1型磁力搅拌器（北京中兴伟业仪器有限公司）、三口瓶、双连球等。 　　色谱甲醇、色谱乙腈（Fisher， USA），娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），其他试剂均为分析纯。 　　新鲜的金银花于2012年5月采自山东济南，经中国中医科学院中药研究所王智民研究员鉴定为忍冬科植物忍冬L. japonica的花蕾。晒干样品：新鲜金银花摊开晾晒于太阳下至干燥即得；硫磺熏蒸样品：新鲜金银花摊开放于支架上的透气金属网筛中（不宜太厚），支架下端用铁质器具装入一定量硫磺粉末，点燃硫磺粉末出现蓝紫色火焰，将整个装置用塑料布密封，使硫磺黄色烟雾充满装置，熏制过夜，熏制后的金银花晾于阴凉处，阴干即得。 　　2方法与结果 　　2.1断马钱子酸的分离制备 　　前期研究表明，晒干金银花样品中断马钱子酸的含量较高[3]，因此选择晒干样品进行该化合物的目标性分离制备。干燥的金银花样品（粉碎，311 g）用17 L 50%乙醇渗漉提取，渗漉液回收溶剂至无醇味（约2 300 mL），离心（3 500 r?min-1，20 min），上清液（约2 100 mL）上HPD-100大孔吸附树脂柱，依次用5倍柱体积的水，10%，20%，30%，40%，95%乙醇洗脱，TLC和HPLC进行流分检查，20%，30%乙醇洗脱部分富集断马钱子酸，合并后得10.3 g固体粉末，上硅胶柱（300～400目，氯仿-甲醇-水15∶4∶0.4）进行粗分，ODS柱纯化（10%甲醇洗脱），得到单体化合物（277 mg）。经HPLC面积归一化法检测其纯度为94%；经HPLC比对保留时间，在线紫外吸收以及质谱数据，确证该化合物为断马钱子酸。晒干金银花50%甲醇超声提取液和断马钱子酸在同一色谱条件下的HPLC图见图2。Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为1.4 %甲酸水（A）和乙腈（B），梯度洗脱（0～20 min，3%～8% B；20～45 min，8%～15% B；45～60 min，15%～24% B；60～70 min，2