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单子叶植物表达载体pUN3300构建 　　摘要：植物双元表达载体在植物基因工程研究中具有重要作用，表达载体所包含的结构元件，如启动子、多克隆位点、筛选标记等，对植物遗传转化效率、外源基因表达强度及遗传稳定性等具有重要影响。本研究中，为提高目的基因对单子叶植物的遗传转化效率，对植物表达载体pCAMBIA3300进行改造，在原有以bar基因作为选择标记的基础上，采用不完全酶切的方法添加了Ubiquitin启动子，经酶切、测序表明，植物双元表达载体pUN3300构建成功。该载体对于研究外源基因功能、植物性状改良及新品种的培育，具有重要的价值。 　　关键词：单子叶植物；表达载体；pUN3300；Ubiquitin启动子；bar基因 　　中图分类号：Q781文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0034-04 　　植物双元表达载体是植物基因工程研究的重要组成部分。通过植物表达载体，外源目的基因可进入宿主细胞并高效表达，为阐明基因功能、利用基因资源改良作物种质奠定了基础[1～3]。获得稳定、高效的植物双元表达载体是进行遗传转化研究的重要内容之一。目前，虽已有pBR121、pCAMBIA等系列的商业化表达载体出售，但并不能完全满足实验需求，因此，必须根据实际需要对表达载体进行改造。表达载体上携带的抗性标记基因是筛选转化体的有效手段，但同时也带来了生态环境及食品安全方面的潜在隐患，影响了大众对转基因植物的接受。而以除草剂抗性bar 基因作为筛选标记，具有一定的生物安全性，客观上可消除人们的顾虑[4]。因此本研究中，选取以bar 基因为筛选标记的商业化表达载体pCAMBIA3300为基础，通过不完全酶切等方法添加了单子叶植物高效、专一性启动子Ubiquitin，构建并获得了适于单子叶植物遗传转化的表达载体pUN3300，为外源目的基因对单子叶植物的遗传转化提供了有力的分子生物学工具。 　　1材料与方法 　　11试验材料 　　植物表达载体pCAMBIA3300、含有Ubiquitin启动子的植物表达载体pUN1301由本实验室保存。大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金公司，各种限制性内切酶、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、T4 DNA连接酶购自大连宝生物工程有限公司，其他各种试剂均为国产分析纯产品。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。 　　12试验方法 　　121Ubiquitin启动子表达元件的获得用HindⅢ单酶切植物表达载体pUN1301，电泳回收后用EcoRⅠ不完全酶切，产物经08%琼脂糖凝胶电泳，回收产物2 240 bp，即为Ubiquitin启动子表达元件。 　　122单子叶植物表达载体pUN3300的构建用Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ双酶切植物表达载体pCAMBIA3300，获得长度为8 400 bp的产物，该回收产物与上步获得的Ubiquitin启动子表达元件混合后，经T4连接酶16℃连接过夜。热激转化大肠杆菌DH5α，将转化产物涂布平板，在含有Kan （50 mg/L）的培养基上筛选，筛选到的阳性克隆经质粒提取，获得载体pUN3300。 　　123单子叶植物表达载体pUN3300的鉴定利用DNAMAN软件，分别在Ubiquitin启动子、bar基因上设计PCR检测引物UbiF：5′-CAAATCCACCCGTCGGCACCTC-3′；BarR：5′- CTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGCGTG-3′，预期产物长2 350 bp。PCR检测程序为：95℃变性30 s，64℃退火45 s，72℃延伸2 min，35个循环。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后检测特异条带。将鉴定正确的菌液培养后提取质粒，经PstⅠ、SalⅠ双酶切鉴定，构建正确的植物表达载体命名为pUN3300（图1）。 　　2结果与分析 　　21Ubiquitin启动子表达元件的获得 　　pUN1301质粒由pCAMBIA1301在多克隆位点处克隆入一个Ubiquitin启动子表达元件后得到。由于Ubiquitin启动子内部约1 400 bp处含有EcoRⅠ酶切位点，为获得完整的Ubiquitin启动子表达元件，经HindⅢ单酶切后，其回收产物进一步用稀释10倍的EcoRⅠ酶切3 min，进行不完全酶切。 　　电泳结果如图2所示，两条酶切条带分别为2 017 bp和1 400 bp，其中2 017 bp是目的条带，进一步将其切胶回收，获得包含Ubiquitin启动子和Nos末端的Ubiquitin启动子表达元件。 　　22单子叶植物表达载体pUN3300的构建与检测 　　将pCAMBIA3300载体酶切产物与Ubiquitin启动子表达元件连接后转化大肠杆菌，通过PCR与酶切鉴定质粒重组情况。利用在Ubiquitin启动子和b