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东莨菪内酯对家蚕乙酰胆碱酯酶活性影响 　　摘要：用不同浓度天然产物东莨菪内酯处理桑叶饲喂家蚕（Bombyx mori）后，通过测定家蚕头部乙酰胆碱酯酶（AChE）活性，研究东莨菪内酯对家蚕的影响。结果表明，12 h时家蚕出现摆头、吐液等轻微中毒症状，24 h时中毒症状减轻，48 h时中毒症状消失，家蚕恢复正常；5龄第三天家蚕饲喂浸过不同浓度东莨菪内酯的桑叶后，头部AChE比活力变化趋势与对照变化趋势相反，且除了药后24 h时的比活力高于对照外，其余时间段比活力均显著低于对照，表现为抑制作用；在一定浓度范围内，东莨菪内酯对家蚕头部离体AChE活性的抑制作用呈剂量效应关系，且抑制率随东莨菪内酯浓度的升高而升高。5.0×10-2、 　　2.5×10-2 mol/L东莨菪内酯对家蚕头部离体AChE活性的抑制率分别达到99.4%、90.6%，当东莨菪内酯浓度小于5.0×10-4 mol/L时，其对家蚕头部离体AChE活性的抑制趋势逐渐变缓，抑制中浓度IC50为4.03×10-3 mol/L。 　　关键词：东莨菪内酯；家蚕（Bombyx mori）；乙酰胆碱酯酶 　　中图分类号：S881.2； S482.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-1106-03 　　乙酰胆碱酯酶（Acetyleholinesterase，AChE）是昆虫神经系统中最重要的酶系之一，在中枢及外周神经系统中与乙酰胆碱受体一起参与完成神经-神经、神经-肌肉突触之间动作电位的传递，其主要生理功能是催化水解阳离子性神经递质乙酰胆碱，维持神经冲动正常传递[1]。若乙酰胆碱酯酶与杀虫剂接触，其活性部位与杀虫剂不可逆地结合，导致乙酰胆碱不能被水解，酶失活，乙酰胆碱在突触处积累，过量的乙酰胆碱造成去极化阻断，从而抑制正常的神经传导，导致昆虫中毒死亡[2，3]。东莨菪内酯（Scopoletin）又称莨菪亭、莨菪酚、东莨菪甙元、7-羟基-6-甲氧基香豆素等，是广泛存在于植物中的香豆素类化合物，大部分的药用东莨菪素是从伞形科植物防风、白云花和旋花科植物丁公藤和光叶丁公藤中提取而来[4]，是一种天然产物，且在桑树的叶、根、皮中也含有此类物质。 　　研究表明，有机磷、氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶（AChE）有强烈的抑制作用[5-7]。在天然产物活性物质中，AChE的酯动部位抑制剂毒扁豆 　　碱 [8，9]，以其为模板合成的氨基甲酸酯类农药已经成为一种农药生产上的主要杀虫剂。但东莨菪内酯对昆虫体内乙酰胆碱酯酶的活性影响研究的报道较少，本研究选择鳞翅目模式生物昆虫家蚕（Bombyx mori）作为研究对象，通过研究东莨菪内酯对家蚕活体和离体乙酰胆碱酯酶活性的影响，为进一步探讨东莨菪内酯杀虫机理提供参考，为以后开发既不影响家蚕正常生长发育又能防治桑树害虫的东莨菪素类植物源杀虫剂提供参考依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 供试虫源 　　家蚕品种：菁松×皓月，由云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所提供。 　　1.2 主要试剂和仪器 　　主要试剂：东莨菪内酯（Scopoletin），由西南大学植保学院天然产物农药研究室提供； 　　1.6 mmol/L 碘化硫代乙酰胆碱（Acetylthiocholine iodide，ATChI），ACROS ORGANICS公司生产；5，5’-二硫代双硝基苯甲酸[5，5’-dithio-bis （2-nitrobenzoic acid）]（DTNB），Damas-beta公司生产；1 mg/mL牛血清白蛋白标准品（Albumin bovine serum），云科生物工程公司生产；考马斯亮蓝G-250，北京索莱宝科技有限公司生产。 　　主要仪器：高速冷冻离心机、xMark酶标仪、玻璃匀浆器。 　　1.3 活体抑制施药方法 　　采用浸叶法，将新鲜桑叶分别浸入不同浓度（0.104、0.078、0.052、0.026 mol/L）的东莨菪内酯药液中，叶片全部浸湿，对照以蒸馏水浸叶，10 s后取出室温条件下自然晾干，按正常的饲喂量饲喂5龄第三天家蚕，每个浓度3次重复，饲喂3 h后，去除未吃尽的桑叶，之后以新鲜无毒桑叶饲喂，观察家蚕中毒症状，且每隔8 h取家蚕于-80 ℃冰箱保存待用，至48 h，共取样6次。 　　1.4 活体抑制粗酶液制备 　　将所取样品家蚕头部剪下，0.9% NaCl生理盐水清洗，以1：5（m：V）的比例于0.01 mol/L磷酸缓冲液（1 mmol/L EDTA，l% TritonX-100，1 mol/L NaCl，pH 8.0）冰浴，研磨成匀浆，匀浆液于4 ℃，15 000 r/min离心20 min，取上清液作为待测酶液。 　　1.5 蛋白质及AChE活性测定 　　1.5.1 酶源蛋白质含量测定 参照文献[10]中的考