人类基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析.pptVIP

M: λDNA/HindIII+EcoRI DNA Marker； 1-5: 基因组DNA 基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果图 第七节 结果分析 21226 bp M 1 2 3 4 5 课程相关资源 课程简介 课程简介 《医学分子生物学》国家精品资源共享课，2013（1:4505/） 《医学分子生物学》国家精品课程(本科），2008（ /jpkc2008） 生命科学学院资源共享平台（ ） 谢谢！ xiongdehui@ 0731-8480 5449 * LOGO * * LOGO — * — 目录页 CONTENTS PAGE * LOGO Contents Page 目录页 子目录 TRANSITION PAGE — * — * * 第一节 实验原理 * LOGO 第三节 基因克隆的基本过程 * LOGO * LOGO * LOGO * LOGO 人类基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析 第一节 实验目的 掌握人类基因组DNA提取的基本原理和方法 掌握琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA方法 第二节 实验原理 相关 知识 核酸提取思路： 破膜：细胞膜、核膜 分离：通过酶，有机溶剂，调节pH值，离心等 纯化：去除杂质 DNA提取原则： 保证DNA一级结构的完整性 排除其他分子的污染，使其纯度尽可能高 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染 相关 知识 样品来源： 培养细胞 组织标本 血液样本 相关 知识 实验 原理 用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入SDS破裂核膜，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，经苯酚﹑氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀DNA，75%乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后，溶解于TE中即得到高分子量的DNA。 本次实验使用的试剂盒系直接加入裂解液裂解细胞后，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，再利用特殊硅基质膜吸附DNA的特性，可快速、高效地纯化回收基因组DNA。 离心吸附柱内的硅基质膜在高盐，低pH值状态下选择性地结合溶液中的DNA，再通过漂洗液将杂质去除，最后低盐，高pH值的洗脱缓冲液或去离子水将DNA从硅基质膜上洗脱。 高盐，低pH值： 选择性结合 DNA 漂洗 低盐，高pH值： DNA从硅基质膜上洗脱 第三节 主要试剂 主要试剂 培养细胞 RNase A（100mg/ml） Protease Buffer GR Buffer GL 无水乙醇 Buffer GW1 Buffer GW2 Buffer GE 第四节 主要仪器 微量移液器 台式微量离心机 电泳仪 凝胶成像系统 主要仪器 第五节 操作步骤 1.样品处理：取1管细胞，做好标记，5000rpm离心3分钟，弃上清，收集细胞。 3.向以上溶液中加入20 μl Protease K，混匀。 4.加入200 μl Buffer GL，颠倒混匀15次，剧烈震荡至少1分钟。 注意：不要直接将Protease直接加入到Buffer GL。 5. 56℃孵育10分钟，其间颠倒混匀数次 6.加入200 μl无水乙醇，颠倒混匀10次，剧烈震荡。短暂离心，使管壁和壁盖上  的液体集中到管底。 第五节 操作步骤 7.将步骤5所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，吸附柱重新放回收集管中。 2.加入200μl GR，用移液器反复吸打几次，使细胞悬浮。 10.吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入60μl Buffer GE， 室温放置2分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。 7.向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1，12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的  废液，将吸附柱重新放回收集管中。 8.向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2，12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的 废液，将吸附柱重新放回收集管中。 9.10,000 rpm离心2分钟，倒收集管中的废液。吸附柱置室温2分钟，以彻底晾干。 第五节 操作步骤 11.取5 -10μl基因组DNA，并加入2 μl上样缓冲液，混匀，加样到1％琼脂糖凝胶点样孔中，电泳检测分析。 第六节 注意事项 （1）试剂配制及保存规范，离心管及Tip头需经高压灭菌处理。 （2）基因组DNA长而弯曲，易断裂。操作过程中尽量轻缓，避免过度的 溶液