酶工程10下1.pptVIP

* 意为“分离” * jl;jljl;kjnlk;jlk;jkkukgj * （1）克隆酶的生产。即用DNA重组技术，大量生产酶。 例如：用DNA重要技术将人尿激酶原的结构基因，从人细胞转移到大肠杆菌细胞内，可以使大肠杆菌细胞生产尿激酶原。 （2）突变酶的生产：即用蛋白质工程技术，定点改变酶结构基因，生产性能稳定，活性更 高的酶。 例如：酪氨酰-tRNA合成酶的突变酶，其为Ala 51取代了Thr 51，从而使该酶对底物ATP 的亲和活力提高了 100倍。 （3）新酶的生产：即用蛋白质工程技术，设计新的酶结构基因，生产的自然界中从未有过的性能稳定、活性更高的酶。 （2）突变酶的生产：即用蛋白质工程技术，定点改变酶结构基因，生产性能稳定，活性更 高的酶。 例如：酪氨酰-tRNA合成酶的突变酶，其为Ala 51取代了Thr 51，从而使该酶对底物ATP 的亲和活力提高了 100倍。 （3）新酶的生产：即用蛋白质工程技术，设计新的酶结构基因，生产的自然界中从未有过的性能稳定、活性更高的酶。 （1）克隆酶的生产。即用DNA重组技术，大量生产酶。 例如：用DNA重要技术将人尿激酶原的结构基因，从人细胞转移到大肠杆菌细胞内，可以使大肠杆菌细胞生产尿激酶原。 酶和细胞固定化示意图 吸附法 天然酶和固定化酶在应用中的一些比较 1、酶稳定性差，易变性失活 1、稳定性高 2、酶和底物只能反应一次，难于回收利用，不仅成 本高，而且难于连续化生产。 2、多次使用，易于回收，节约成本。装塔连续，用于自动化生产 3、反应液中混入酶蛋白，使产品的分离纯化复杂化 3、纯化简单，提高产物的质量 葡萄糖氧化酶电极： 固定化酶在传感器方面的应用： 酶传感器：固定化酶与能量转换器(电极、场效应管、离子选择场效应管等)密切结合而成的传感装置，是生物传感器的一种。已广泛应用于临床诊断、工业发酵过程控制和环境监测等领域。其中研究最多、应用最广的是酶电极。 第三节 酶的分离纯化 一、酶制剂的制备 二、酶的纯化与精制 三、酶的纯度与酶活力 四、酶的保存 提取和分离纯化酶时一般应注意的条件 温度 pH值 搅拌 微生物污染　 酶活性测定 要进行比活力，总活力测定与比较 比活力= 酶活力（单位）/mg蛋白 HPLC 一、酶制剂的制备 （机械、物理、化学、酶学破碎法） （盐溶液、酸溶液、碱溶液、有机溶剂提取） 高速冷冻离心机 破碎细胞 溶剂抽提 离心分离 浓缩 干燥 常速、高速、超速：转速8000r-25000r-80000r/min 二、酶的纯化与精制 在酶的提取液中，不可避免地杂有其它小分子和大分子物质，其中，小分子杂质在相继的纯化步骤中一般会自然地除去； 而大分子杂质包括有：核酸、粘多糖、其它蛋白质。核酸可加硫酸链霉素，聚乙烯亚胺，鱼精蛋白或MnCl2等，使之沉淀移去，也可使用核酸酶降解。粘多糖则常用醋酸铅、乙醇、丹宁酸和离子型表面活性剂等处理。 而纯化的主要工作，也是较困难的工作，就是要将酶从杂蛋白中分离出来 酶纯化中常用方法 超速冷冻离心机 1、根据酶分子大小和形状的分离方法 离心分离 凝胶过滤 透析与超滤 2、根据酶分子电荷性质的分离方法 离子交换层析 层析聚焦 电泳 电泳仪 3、根据酶分子专一性结合的分离方法 亲和层析 利用酶分子具有的专一而又可逆的亲和力，是生物分子分离纯化的技术；它具有结合效率高、分离速度快的特点。 层析分离 实例 从猪肉中纯化腺苷酸激酶。 其催化反应为： 纯化步骤：见下图 三、酶的纯度与酶活力 酶的活力：酶活力高低是以酶活力的单位数表示 1kat＝特定条件下，每秒钟使1mol底物转化为产物所需要的酶量 酶的比活力：比较酶的纯度和活力的高低 比活力= 酶活力（单位）/mg蛋白质或RNA 酶的纯度：酶的比活力代表酶的纯度，但不说明实际纯净程度是多少 总活力的 ＝ 回收率（产率) 某步骤后的总活力 第一次总活力 纯化倍数 ＝ 某步骤后的比活力 第一次比活力 （反映提纯过程中酶活力损失情况） （反映了纯化方法的效率） 每一步骤前后都要进行酶活力测定，并做出总活力、比活力比较 酶制剂的保存 温度: pH和缓冲液: