牵张应力对mc3t3-e1和人牙周膜细胞成骨分化的影响及相关信号通路调控作用研究-effects of tensile stress on osteogenic differentiation of mc 3t3 - e1 and human periodontal ligament cells and related signal pathway regulation.docxVIP

博 博 士 学 位 论 文 PDF PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 HYPERLINK / 牵张应力对 MC3T3-E1 和人牙周膜细胞成骨分化 的影响及相关信号通路调控作用研究 中文摘要 应力刺激是调节骨代谢、维持骨量和骨功能结构的重要因素之一。应力 状态下的牙周组织改建是口腔正畸临床矫治的生物学基础，在机械应力刺 激下，通过对牙周膜细胞以及成骨细胞生物学功能的调节，最终实现正畸 牙齿的移动，同时维持牙槽骨组织应力改建的平衡。目前尽管人们对成骨 细胞及牙周膜细胞的力学生物反应进行了大量的研究，包括其增殖、分化， 功能状态、成骨或破骨相关细胞因子的表达，胞内信号转导通路等，但成 骨细胞或牙周膜细胞对应力刺激的识别机制、信号转导机制、生物响应机 制等还并不十分清楚，尤其是对其生物力学信号转导通路调节机制以及不 同信号通路之间相互作用及相互关系知之 甚少。细胞外信号调节激酶 (extracellular signal regulated kinase 1/2，ERK1/2)信号通路和核因子 κB ( Nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路是细胞内应力信号转导过程中两条 重要的信号转导通路，在成骨前体细胞及牙周膜细胞成骨分化过程中发挥 着重要作用。因此本研究通过 MC3T3-E1 成骨样细胞以及人牙周膜细胞的 体 外 培养 ， 通 过 建 立 细胞 体 外牵张应力 加载模 型 ， 观察 牵张应力对 2 MC3T3-E1 成骨样细胞或人牙周膜细胞成骨分化及相关基因表达的影响，了 解牵张应力对 ERK1/2 与 NF-kB 信号通路的影响及两条通路之间的相互作 用关系。 实验一：牵张应力对 MC3T3-E1 细胞成骨分化及相关基因表达的影响 本研究通过 MC3T3-E1 成骨样细胞体外培养，观察不同大小牵张应力 刺激后，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、I 型胶原（COLⅠ）、骨保 护素(osteocalcin,OCN)、白细胞介素-6 等基因表达的变化，研究发现，在 8% 及 12%细胞形变率的周期性牵张应力作用下，MC3T3-E1 细胞碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase,ALP)活性及骨保护素(osteocalcin,OCN)基因的表达明 显降低， 而 ALP 是成骨细胞早期分化的标志， OCN 是成骨细胞成熟的标 志。结果表明，MC3T3-E1 细胞在 8%及 12%细胞形变率的周期性牵张应力 作用 24 小时后抑制了其向成熟的成骨细胞分化的能力。同时研究发现，牵 张应力作用 24 小时后，I 型胶原（COLⅠ）、白细胞介素-6（IL-6）基因表 达显著增加。而 COLⅠ是构成骨组织细胞外基质主要成分之一，说明早期 的应力刺激可以促进骨组织细胞外基质的合成，是骨组织应力改建的物质 基础。IL-6 作为一种多功能细胞因子，参与了正畸牙齿移动过程中牙周组 织的改建，并作为一种有效的破骨细胞活化因子，刺激破骨细胞的生成和 骨吸收活动。 实验二：牵张应力介导 ERK1/2 与 NF-kB 信号通路对 MC3T3-E1 细胞成骨 分化及相关基因表达的影响 通过分别给予ERK1/2信号通路和NF-kB信号通路的特异性抑制剂，在 基因 水平上 了解 牵 张应力作 用 下ERK1/2 信号通 路和 NF-kB 信号 通路对 MC3T3-E1细胞成骨分化及相关基因表达的调控。本研究结果显示，在12% 牵张应力作用下，MC3T3-E1细胞ALP、COLⅠ、IL-6的表达受ERK1/2信号 通路的调控，而OCN基因表达的变化不受ERK1/2通路的影响。NF-kB信号 通路抑制剂PDTH可显著抑制机械牵应张力作用下MC3T3-E1细胞ALP活性 3 的降低，同时抑制IL-6基因的表达，而COLⅠ、OCN基因表达的变化不受 NF-kB信号通路的影响。 实验三：牵张应力对MC3T3-E1细胞ERK1/2与NF-kB信号通路影响的研究 通过观察牵张应力对 MC3T3-E1 成骨样细胞应力信号转导通路 ERK1/2 与 NF-kB 通路本身信号分子的反应，研究牵张应力对 MC3T3-E1 细胞 ERK1/2 与 NF-kB 信号通路的影响及其相互作用关系。研究发现，当 MC3T3-E1 细胞受到 12%细胞形变率的周期性牵张应力作用时，ERK1/2 信 号通路及 NF-κB 信号通路同时被激活，ERK1/2、IKK 磷酸化水平显著提高， NF-kB（p65）表达明显增加，但阻断 NF-κB 信号通路并不会影响 ERK1/2 信号通路的激活。相反当阻断 ERK1/2 信号通路时 NF-kB 信号通路激活受 抑制，说明 ER