病毒c亚型重组病毒样ppt课件.ppt

(B) Western blotting with anti-VP0 polyclonal antibody. (C) Western blotting with anti-VP1 polyclonal antibody. (D) Western blotting with anti-VP3 polyclonal antibody. 七、电子显微镜 VLP 样本用0.5%水样乙酸双氧铀负染, 用Philips CM-12S 放射电子显微镜观察。 Figure 4. Electron microscopy of EV71 VLPs. Partially purified VLPs were negatively stained with 0.5% aqueous uranyl acetate and visualized by transmission electron microscopy. Bar = 50 nm. 八、VLP 免疫小鼠诱导出抗EV71特异的抗体反应 免疫之前, EV71 VLPs 与同样制备的阴性对照 (Sf9) 抗原与明矾(Pierce, Rockford, IL, USA)根据厂商说明，以体积比1:1混合，混合物含有VLPs (相当于 5 mgVP0) 或者 Sf9阴性溶解产物. 每组5只雌性 Balb/c 小鼠(6–8 weeks old) 以 0, 2 和5周次腹腔注射。每次免疫之前，收集血清样本， 在第七周老鼠被处死。血清保存在-80 ℃备用。 九、抗体测定： 用间接ELISA测定血清样本中抗-EV71抗体的反应性。 包被：灭活的EV71 (10 ng/孔)包被96-孔ELISA反应板 37℃3 h. 封闭：用 5% 奶粉 PBST 孵育 37 ℃ 1h. 加血清：用1%奶粉PBST 稀释血清样本37℃ 2h。 二抗：HRP连接抗小鼠IgG 抗体 37 ℃ 1 h。 显色： 显色，450 nm测量OD值 。 Figure 5. Antibody responses following VLP immunization.Groups of five mice were injected i.p. at weeks 0, 2 and 5, with alumabsorbed antigens: EV71-VLP equivalent to 5 mg VP0, or the control lysate similarly prepared from uninfected Sf9 cells. The immunized mice were sacrificed at week 7 (2 weeks after the last immunization), and the serum, bone marrow and spleen samples were collected and assayed.Results are representative of two independent experiments. (A) EV71-specific serum IgG titers of the Sf9 and the VLP groups. Each symbol represents a mouse, and the line indicates the geometric mean value ofthe group. 十、斑点ELISA分析 在最后免疫之后的第三周，收集三只免疫小鼠的脾脏和骨髓，做B细胞ELISPOT。 分离脾细胞和骨髓细胞, 浓缩、计数。96孔PVDF板 (Millipore, Billerica, MA, USA)用纯化灭活的EV71以100 ng/孔 预先包被，4℃孵育过夜。 PVDF 板用完全RPMI 1640培养基37℃封闭2h 。 新鲜分离的脾细胞和骨髓细胞(1×105/孔) 在5% CO2中 37℃孵育40h 。用1% FBS 和 0.05%Tween-20的 PBS缓冲液稀释生物素化的山羊抗-小鼠IgG，以0.1 ug/孔加入到 PVDF板中，37℃ 2h。 然后用PBS以1:1000稀释碱性磷酸酶链接的链霉亲和素 37℃ 1h。 高血压危险因素评估及防治新进展结核病防治临床技能竞赛防控部分培训老痴呆康复训练系统项目计划书雷替曲塞在结直肠癌肝转移及原发性肝癌介入治疗中的应用颅脑损伤和急性脑血管意外的急救护理麻疹疫情调查与处置技术指南 高血压危险因素评估及防治新进展结核病防治临床技能竞赛防控部分培训老痴呆康复训练系统项目计划书雷替曲塞在结直肠癌肝转移及原发性肝癌介入治疗中的应用颅脑损伤和急性脑血管意外的急救护理麻疹疫情调查与处置技术指南 高血压危险因素评估