沙棘弗兰克氏和非弗兰克氏放线菌的分离 培养及分子鉴定-isolation, culture and molecular identification of franchi and non - franchi actinomycetes from hippophae rhamnoides l..docx

万方数据 万方数据 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得本研究生培养单位或 其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解中国林业科学研究院有关保留、使用学位论文的 规定，中国林业科学研究院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件 和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权中国林业科学研究院可以将学位论文 的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签名： 年 月 日 年 月 日 学位论文作者毕业联系方式 工作单位： 联系电话： 电子邮件： 通讯地址、邮编： 摘 要 沙棘(Hippophae rhamnoides L.)属胡颓子科沙棘属植物，是我国北方半干旱 地区的先锋树种，因其能与弗兰克氏菌（Frankia）共生在根部形成固氮根瘤， 能将大气中分子态的氮还原成氨供植物吸收利用，能在瘠薄土壤和较恶劣的环境 中生长，是改良土壤、治理水土流失、改善生态环境的优良生态经济型树种。并 且，沙棘的果、叶和种子中含有大量的营养成分和对人体有重要意义的生物活性 物质。 为了更好的开发利用沙棘共生固氮特性，本论文对沙棘根瘤弗兰克氏菌的分 离培养条件及其系统发育地位进行了初步的研究，主要的实验结果如下： （1）沙棘根瘤弗兰克氏菌的系统发育地位。采集不同生态环境不同沙棘品种 的根瘤，从根瘤内直接扩增 DNA，共得到 39 条根瘤内生菌的 16SrDNA 序列， 属于 20 个单倍型，其中磴口沙棘根瘤内生菌的 16SrDNA 序列有 19 条，属于 4 个单倍型，孙吴的根瘤内生菌的 16SrDNA 序列有 20 条，属于 16 个单倍型，两 个地区间的根瘤内生菌没有共享的单倍型，不存在基因交流。基于基因库中下载 的和沙棘根瘤扩增的 16SrDNA 序列构建系统发育树，将不同地域、不同宿主来 源的弗兰克氏菌分为 4 个明显的分支，包括胡颓子侵染组、杨梅-木麻黄-赤杨侵 染组、非典型菌株和未获得纯培养的根瘤弗兰克氏菌组。其中来自沙棘根瘤的内 生菌以 52%的支持率全部聚在了胡颓子侵染组，均属于弗兰克氏菌。 （2）沙棘根瘤内生菌的分离、培养。实验选取新鲜幼嫩的沙棘根瘤，采用 BAP 培养基和 QMOD 培养基，经根瘤匀浆法和切片法从表面消毒的根瘤中分离 根瘤内生菌，经纯化得到 18 个纯培养菌株，其中通过切片法分离到 14 株，匀浆 法得到 4 株。研究发现，根瘤切片法、BAP 培养基及液体培养的方式更适合沙 棘根瘤内生菌的分离，液体培养能有效的分离菌株，菌落出现时间比固体分离早 7-10 天左右。 （3）沙棘根瘤纯培养菌株的形态特征和分子鉴定。从沙棘根瘤中分离的 18 株纯培养菌株除了 JYY61、JYY62，其余都具有发达的气生菌丝，在显微镜下所 有菌株都有分支状的菌丝，但没有弗兰克氏菌典型的泡囊及孢子囊结构，均不属 I 于弗兰克氏放线菌。根据基内菌丝和气生菌丝发育情况、菌丝与培养基结合程度、 液体培养是否产生菌膜以及菌丝有无隔膜、孢子分化等形态培养特征，将来自沙 棘 根 瘤 的 18 个 菌 株 分 为 两 类 ， 并 初 步 判 定 第 一 类 菌 株 属 于 诺 卡 氏 菌 属 （Nocardia），第二类菌株属于小单孢菌属（Micromonospora）。基于网上下载和 实验得到的 16SrDNA 基因序列构建的系统发育树（NJ 树和 MP 树），18 株非 弗兰克氏放线菌被分为明显的两个分支，分别属于诺卡氏菌属分支和小单孢菌属 分支，16SrDNA 基因序列分析的系统分类结果支持基于菌株形态培养特征划分 的两个类群。 关键词：沙棘，根瘤，弗兰克氏菌，非弗兰克氏放线菌，系统发育 II Abstract Hippophae rhamnoides L. Elaeagnaceae is a pioneer plant in the northern semi-arid region of China. The root of Hippophae rhamnoides can fix nitrogen from atmosphere for plant growth in symbiosis with Frankia. This species has a wide adaptability and c