水牛颗粒细胞凋亡相关基因和mirna表达及雌二醇对其表达调控的研究分析-expression of apoptosis-related genes and mirna in buffalo granulosa cells and the regulation of estradiol on their expression.docxVIP

分类号S814.8密级UDC编号硕士学位论文水牛颗粒细胞凋亡相关基因和miRNA表达及雌二醇对其表达调控的研究李润学科专业动物遗传育种与繁殖指导教师李湘萍研究员石德顺研究员论文答辩日期2014年5月25日授予日期答辩委员会主席卢克焕教授广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：□保密，在年解密后适用授权。□不保密。(请在以上相应方框内打“√”)论文作者签名：日期：指导教师签名：日期作者联系电话子邮箱：261034417@水牛颗粒细胞凋亡相关基因和miRNA表达及雌二醇对其表达调控的研究摘要哺乳动物卵泡在发育过程中，除少量发育成熟并排卵外，绝大部分发生退化、闭锁。研究表明，卵泡闭锁的主要诱因是颗粒细胞凋亡。目前已有人、鼠、牛、猪、绵羊和山羊等动物的颗粒细胞凋亡及其调控机理的研究报道，但对水牛卵泡颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁的分子机制研究较少。为此，本试验首先对不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞凋亡相关基因及miRNA的表达规律进行了分析，以了解颗粒细胞凋亡与卵泡闭锁的关系，初步阐明水牛卵泡闭锁的分子机制。其次，通过研究雌二醇（E2）对体外培养的水牛颗粒细胞凋亡、细胞周期、凋亡相关基因和miRNA表达的影响，探索E2在调控水牛颗粒细胞凋亡过程中的作用，为优化颗粒细胞体外培养条件以及进一步了解水牛卵泡闭锁机理奠定基础。一、不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞凋亡相关基因和miRNA的表达。1.采用HE染色、DNAladder分析和Tunel法检测了HF、EF和PF三种不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞的凋亡状态。结果发现，HF卵泡腔中无脱落的颗粒细胞，其中的颗粒细胞基因组DNA没有出现明显的DNAladder，细胞凋亡率为9.32%。EF卵泡内壁结构较松散，卵泡腔中可见到有少量脱落的颗粒细胞，其颗粒细胞基因组DNA出现明显的DNAladder，细胞凋亡率为17.24%。PF颗粒细胞大部分脱落于卵泡腔中，卵泡内壁退化严重，基因组DNA降解严重，出现明显的DNAladder，凋亡率达20.26%。2.利用qRT-PCR方法分析了不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞凋亡相关基因和miRNA的表达。结果显示，死亡受体通路相关的Fas等基因在HF、EF、PF三种颗粒细胞中均有表达，且随着卵泡闭锁程度加深，其表达量显著升高（P＜0.05）。TNFα基因在HF颗粒细胞中不表达而在EF和PF中表达，TRAIL基因在三种颗粒细胞中均不表达。所检测的线粒体通路相关基因在三种颗粒细胞中均有表达，其中Bcl-2、Bcl-xl和MCL-1基因在HF颗粒细胞表达最高，随着卵泡闭锁程度加深，其表达量逐渐降低；Bax等基因在PF颗粒细胞表达最高，且随着卵泡闭锁程度加深其表达量逐渐升高。内质网应激通路相关基因在三种颗粒细胞均有表达，且随着卵泡闭锁程度加深其表达量逐渐升高。所检测的包括miR21-5P在内的16条miRNA在HF、EF和PF颗粒细胞均有表达，其中miR21-5P等10条miRNA的表达水平随着卵泡闭锁程度加深呈先升高后下降的趋势；miR99a-5P等6条miRNA的表达量随着卵泡闭锁程度加深而逐渐降低。3.运用免疫组化方法分析了细胞凋亡相关蛋白Fas和Caspase3在不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞中的表达。结果显示，Fas和Caspase3蛋白在HF、EF、PF颗粒细胞中均有表达，且随着卵泡闭锁程度加深其表达水平逐渐增强。二、E2对体外培养水牛颗粒细胞凋亡的影响及其调控机制。1.采用Tunel法分析了E2对体外培养水牛颗粒细胞凋亡的影响。结果发现，浓度为10-5mol/L的E2能够有效抑制颗粒细胞凋亡，且呈现出剂量依赖性；而雌激素受体抑制剂ICI182780能够阻断这一效应。2.采用流式细胞仪分析了E2对水牛颗粒细胞细胞周期的影响。结果显示，单独添加10-5mol/LE2处理颗粒细胞后，G0/G1期细胞比例减少，S期细胞比例显著增加，ICI182780单独处理和E2+ICI182780联合处理的样品细胞周期均没有显著变化。3.利用qRT-PCR技术分析