蛇皮果性别相关分子标记的分析-analysis of sex-related molecular markers in snakeskin fruit.docxVIP

万方数据 万方数据 Dissertation for the Degree Study on molecular markers linked to sex of salacca zalacca Candidate: Li Jianguang Supervisor: Li Rongsheng Associate Supervisor: Yin Guangtian Yang Jinchang Academic Degree Applied for: Master Degree Speciality: Silviculture Date of Defence : June 2012 Degree-Conferring-Institution: Chinese Academy of Forestry 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得本研究生培养单位或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解中国林业科学研究院有关保留、使用学位论文的规定，中 国林业科学研究院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅。本人授权中国林业科学研究院可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签名： 年 月 日 年 月 日 学位论文作者毕业联系方式 工作单位： 联系电话： 电子邮件： HYPERLINK mailto:ljg.84@163.com ljg.84@163.com 通讯地址、邮编： 摘 要 蛇皮果（Salacca zalacca (Gaertner) Voss ex. Vilm.）为棕榈科（Palmae）蛇皮果属 （Salacca）果树，原产于马来半岛至爪哇一带，引进我国已有 20 多年历史。有性繁殖是 蛇皮果繁殖的重要方式，然而有性繁殖的蛇皮果苗木难以从形态上区分其性别，用实生 苗造林时无法对雌雄比例进行合理配置。有鉴于此，本文通过 RAPD 分子标记技术找出 了与蛇皮果性别相关的雄性特异性片段并转化为 SCAR 标记，从而实现了蛇皮果的早期 性别鉴定。研究结果不仅可用于鉴别蛇皮果实生苗的性别，还可与种胚组培技术相结合 形成蛇皮果雌苗快繁技术体系，为实现按需提供雌雄苗木提供技术支撑，改变现有雌雄 混杂造林带来的局限。因此，本研究对于提高我国蛇皮果栽培水平具有重要意义。 1、以蛇皮果新鲜叶片为材料，测试 CTAB 法、SDS 法、CTAB-free 法和改良 CTAB 法等 4 种蛇皮果基因组 DNA 提取方法，结果表明：改良 CTAB 法能有效地去除酚类物质、 多糖和蛋白质的干扰，是蛇皮果基因组 DNA 的有效提取方法。 2、以上述提取方法提取的蛇皮果基因组 DNA 为材料，通过调节 Mg2+浓度、dNTPs 浓度、Taq DNA 聚合酶浓度以及退火温度观测反应产物的电泳效果，结果表明：PCR 扩 增体系为 15μL：10×buffer 1.5μL，0.12mmol/L dNTPs，0.12U/μL Taq DNA 聚合酶， 1.4mmol/L Mg2+，1.0μmol/L RAPD 引物，12ng DNA 模板。PCR 扩增程序为：94℃预变 性 2min；再 40 个循环：94℃变性 30s，39℃退火 30s 和 72℃延伸 2min；最后 72℃延伸 10min。 3、利用上述 1 和 2 确定的方法，以蛇皮果‘Pondoh’品种雌雄株各 10 株为材料， 筛选了 900 条随机引物，结果表明：只有引物 S1431（序列：5’-CCTGGGTCAG-3’）产生 了一条大小约为 1600bp 的雄性特异片段。利用 S1431 引物对同一蛇皮果林另外随机抽取 的蛇皮果雌雄株各 10 株进行检测，所得结果相同，说明 RAPD 分子标记具有鉴别蛇皮果 性别的可行性。 4、对蛇皮果 RAPD 分子标记获得的雄性特异片段进行克隆和测序，结果表明：该特 异性片段为一条 1640bp 碱基的序列，具体序列省略。 5、根据测序所得的序列结果进行分析，设计出一对大小为 18bp 的 SCAR 标记引物 I LF（5’-AGCACAGCCTAGTTAGTT-3’）和引物 LR（5’-TGACACCTCCTCCCATAT-3’）， 利用