双荧光素酶报告基因检测mir-185和akt1靶标关系-detection of the relationship between mir - 185 and ak t1 target by dual luciferase reporter gene.docxVIP

双荧光素酶报告基因检测miR-185与AKT1靶标关系中文摘要【目的】本课题小组前期实验研究发现，在A549,NCI-H1975,NCI-H1650和LTEP-a-2四种非小细胞肺癌细胞株中miR-185表达明显下调，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（Serine/threonineProteinKinase1,AKT1）表达明显升高，二者表达呈负相关关系，提示miR-185对AKT1具有调控作用，AKT1可能是miR-185的潜在靶基因，但不能确定二者直接相关。为了研究miR-185与AKT1之间靶标关系，本实验构建克隆有目的基因片段的双荧光素酶报告基因载体，利用双荧光素酶报告基因检测系统验证二者相互关系。为后续进一步探讨miR-185和AKT1基因在肺癌发生、发展过程中可能机制提供实验基础。【方法】利用生物信息学软件，预测miR-185调控AKT1基因结合序列，设计合成AKT13’-UTR序列及突变后AKT13’-UTR序列，将合成的两种目的基因片段，分别克隆到pmirGLO双荧光素酶报告基因载体，构建AKT13’-UTR双荧光素酶报告基因野生型载体（pmirGLO-AKT1）及其突变型载体（pmirGLO-mut-AKT1）。重组载体经PCR电泳和基因测序鉴定，以证明重组载体构建成功。使用转染试剂lipofectamineTM2000分别将这两种重组载体质粒与miR-185模拟物（mimics）或miR-185阴性对照（NegativeControl,NC）共转染293T细胞，并利用双荧光素酶检测系统检测其活性。双荧光素酶报告基因载体中含有能在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶基因，一个是萤火虫荧光素酶报告基因，另一个是海肾荧光素酶报告基因。萤火虫荧光素酶报告基因为主要报告基因，目的基因片段被克隆至萤火虫荧光素酶报告基因下游的多克隆位点上（Mμltiplecloningsite,MCS）。若目的基因表达被抑制，则使萤火虫荧光素酶转录过程受阻，抑制萤火虫荧光素酶蛋白翻译，萤火虫荧光值下降，而作为标准化内参照的海肾荧光素酶的表达不受影响，此时萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性值下降，从而可以确定miRNA与靶基因是否具有直接调控作用。【结果】PCR电泳及基因测序结果显示，PCR扩增得到的含有AKT13’-UTR和突变后AKT13’-UTR序列的目的片段大小及序列与GeneBank报道序列一致，且插入方向正确。因此，成功构建含有miR-185结合位点的和其突变位点的两种重组质粒。双荧光素酶报告基因检测系统结果显示，转染克隆有AKT13’-UTR突变型载体质粒实验中，miR-185组与阴性对照组比较，荧光素酶的活性值差异无显著性（F=2.29,P0.05）；转染克隆有AKT13’-UTR载体质粒实验中，miR-185组荧光素酶活性明显受到抑制，与阴性对照组比较，荧光素酶的活性差异有显著性（F=80.39,P0.05）。【结论】成功构建AKT1基因3’-UTR双荧光素酶报告基因载体及其突变型载体；AKT1基因是miR-185直接作用的靶基因，且miR-185结合于AKT1基因的3’-UTR区域，在转录后水平对AKT1基因有直接抑制作用。【关键词】微小RNA-185，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1，pmirGLO载体，3’-端非编码区，双荧光素酶报告基因检测系统ResearchontargetrelationshipbetweenmiR-185andAKT1byDualluciferasereportgeneassayAbstractObjective:OurteamfoundthattheexpressionlevelofmiR-185wassignificantdown-regμlationinA549,NCI-H1975,NCI-H1650andLTEP-a-2celllinesinpreviousstudies.ItisanegativecorrelationbetweentheexpressionlevelofAKT1proteinandtheexpressionlevelofmiR-185,anditisalsosuggestingthatmiR-185canregulatetheexpressionofAKT1,andAKT1maybeapotentialtargetgeneofmiR-185,thereisnoenoughevidencetoproveitnow.Inthisstudy,weresearchhowmiR-185regulateAKT13’-untranslatedregion(3’-untranslatedregion,3’-UTR)bydualluciferasereporterassay,toprovideth