《重组DNA技术与基因工程》课件.pptVIP

l 噬菌体生物学特性： 生物结构 5’ TCCAGCGGCGGGG 3’ 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ COS COS cos 头部合成基因 尾部合成基因 溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因 早期控制基因 阻遏基因 重组基因 删除与整合基因 l - DNA 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l 噬菌体生物学特性： 感染周期 E.coli 吸附 LamB受体 注入 复制 包装 裂解 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l 噬菌体生物学特性： 感染周期 体内包装 100个左右的拷贝 包装范围为原DNA的75 - 105% 即 36 - 51 kb D A 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l 噬菌体生物学特性： 溶原状态 l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶菌状态 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：缩短长度 野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体： 插入型载体 取代型载体 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：缩短长度 插入型载体 体外包装 插入位点 体外包装 插入片段 载体长度 37 kb 插入片段大小： 0 - 14 kb （51 – 37） 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：缩短长度 取代型载体 体外包装 体外包装 插入片段 最小装载长度 10 kb （51 – 26） 载体长度 26 kb 插入片段 最大装载长度 25 kb （36 – 26） DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶 T4-DNA酶的基本特性： 在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切 在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止 在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位 5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性 DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ T4-DNA聚合酶 5‘ … G-C-T-C- OH P-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-P HO -C-C-T-C … 5’ 注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多 DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶的基本用途： DNA片段的同位素末端标记 5‘ G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3’ 3‘ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5‘ Mg2+ 5‘ ppp dN 5‘ ppp dA（a-32P-dATP） 5‘ G-C-T-C A-G-C-T-G-OH HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5‘ T4-DNA pol T4-DNA pol 5‘ G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3’ 3‘ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5‘ DNA聚合酶 依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶） 反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链 3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA 反转录酶 Mg2+ dNTP 5’TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18 3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA 5’TTTTTTTTTTTTTT 3’cDNA DNA聚合酶 依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶） 反转录酶的基本特性：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链 反转录酶 3’ RNA 5’