围着床期小鼠子宫hoxa11,meis1,cdh1和ctnnb1在不同控制性超排卵方案下的表达及相互关系的初步研究-preliminary study on the expression of hoxa 11, mei s1, cd h1 and ctn nb 1 in the uterus of peri-bed mice under different controlled ovarian hyperstimulation protoc.docxVIP

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文  PAGE 77 围着床期小鼠子宫内膜 Hoxa11，Meis1，Cdn1 和 Ctnnb1 在不 同控制性超排卵方案下的表达及相互关系的初步研究 中文摘要 第一部分 控制性超排卵处理的小鼠围着床期子宫内膜 Hoxa11， Meis1，Cdn1 和 Ctnnb1 的表达 目的：通过检测控制性超排卵处理小鼠围着床期子宫内膜 Hoxa11，Meis1，Cdn1 和 Ctnnb1 的表达，评估各超排卵方案对子宫内膜容受性的影响。 方法：建立模拟人 IVF 超排卵方案的小鼠模型，分成四组：对照组，GnRH 激动剂组， GnRH 拮抗剂组和单纯 HMG 组，剂量按临床给药换算小鼠使用剂量。在 HCG 日 48 小时后取子宫，样本分成两份冻存于-80℃，一份预备提取 RNA，一份提取蛋白。从 mRNA 水平和蛋白水平检测 Hoxa11，Meis1，Cdn1 和 Ctnnb1 的表达。 结果：Hoxa11, Meis1, Cdh1 和 Ctnnb1 的 mRNA 和蛋白在控制性超排卵的各组和对 照组相比表达都下调。在控制性超排卵的各组中，Hoxa11 和 Ctnnb1 在 GnRH 激动剂 组中表达最低，Meis1 和 Cdh1 在 GnRH 激动剂和拮抗剂组中的表达明显低于 HMG 组，且在 GnRH 激动剂组和拮抗剂组中没有差异。Hoxa11 和 Ctnnb1 的表达在各组中 的变化，Meis1 和 Cdh1 在各组中的表达呈阳性相关。 结论：控制性超排卵能显著下调 Hoxa11, Meis1, Cdh1 和 Ctnnb1 在子宫内膜围着床期 的表达。小鼠子宫 Cdh1 和 Ctnnb1 的表达有可能与 Meis1 和 Hoxa11 的调节相关。 关键词：控制性超排卵，Hoxa11, Meis1, Cdh1，Ctnnb1  第二部分 小鼠荧光表达载 pEGFP-Hoxa11 和 pDsRed-Meis1 的构建 及表达鉴定 目的：为了研究 Hoxa11 和 Ctnnb1，Meis1 和 Cdh1 之间是否存在相互调节关系，构建 荧光表达载体 pEGFP-Hoxa11 和 pDsRed-Meis1。 方法：采用 DNA 重组技术，将目的基因 Hoxa11, Meis1 克隆至含有报告基因 EGFP 和 DsRed 的 pEGFP-N1 和 pDsRed-N1 真核表达中，构建的真核表达载体 pEGFP-Hoxa11 和 pDsRed-Meis1 经 PCR，双酶切及基因测序鉴定；转染至 CHO 细胞，荧光显微镜下 观察重组质粒的表达，提取细胞蛋白 western blot 检测蛋白表达。 结果：pEGFP-Hoxa11 和 pDsRed-Meis1 重组质粒构建成功。构建的真核表达载体 pEGFP-Hoxa11 和 pDsRed-Meis1 能在 CHO 细胞中有效表达。 结论：构建的 pEGFP-Hoxa11 和 pDsRed-Meis1 重组质粒能有效表达 Hoxa11-EGFP 和 Meis1-DsRed 融合蛋白。 关键词：重组质粒，pEGFP-Hoxa11，pDsRed-Meis1  第三部分 子宫内转染 pEGFP-Hoxa11 及 pDsRed-Meis1 分别使 Ctnnb1 和 Cdh1 的表达明显增加 目的：研究 Hoxa11，Meis1 与 Cdh1 和 Ctnnb1 在子宫内膜中的相互关系，为探讨其功 能奠定基础。 方法：将未处理的成熟雌性小鼠和雄性小鼠同笼，发现阴道栓后30-60小时，两侧子宫 角注射pEGFP-Hoxa11 和pDsRed-Meis1重组质粒及其空白质粒，每组5只。妊娠第5天 取小鼠子宫，样本分成三份，一份固定于福尔马林固定剂，备做免疫组化；一份保存 于-80℃，备提取蛋白做Western-blot；一份立即做冰冻切片，荧光显微镜下观察融合 蛋白的表达。 结果：1 Hoxa11-EGFP和Meis1-DsRed融合蛋白在子宫内膜腔上皮细胞，腺细胞和基质 细胞有效表达。 2 Western-blot鉴定Hoxa11和Meis1的表达，Meis1过表达的子宫内膜Cdh1表达增加， Hoxa11过表达的子宫内膜Ctnnb1表达增加。 3 免疫组化切片中Meis1过表达的子宫内膜腔上皮细胞和腺细胞膜表面Cdh1表达明显 增强。Hoxa11过表达的子宫内膜基质细胞中Ctnnb1的表达明显增强。 结论: Hoxa11和Meis1可能与在子宫内膜中Ctnnb1和Cdh1表达的调节有关。 关键词：免疫组化，子宫转染，冰冻切片，Hoxa11，Meis1  Endometrial Hoxa11, Meis1, Cdh1 and Ctnnb1 e