微拟球藻丙二酰coaacp转酰基酶基因克隆及环境胁迫条件下脂肪酸组成变化研究-cloning of propionyl co aacp acyltransferase gene from micrococcus sp. and changes of fatty acid composition under environmental stress.docxVIP

微拟球藻丙二酰 微拟球藻丙二酰 CoA:ACP 转酰基酶基因克隆及环境胁迫条件下脂肪酸组成变化研究 万方数据 万方数据 摘 要 关键词：微拟球藻；转录组学；丙二酰 CoA:ACP 转酰基酶；克隆；油脂代谢；环境胁迫； 脂肪酸 微拟球藻(Nannochloropsis ganada)在物种分类上被划归为褐藻门、大眼藻纲、单 细胞藻类。其油脂含量最高可达占干重的 60%左右，脂肪酸组成主要为 C16 和 C18 类。 该藻被学者认为是最有希望用于生产油脂的海水藻。但目前关于其基因工程产油方面的 研究还较少。针对微拟球藻不同生长时期转录信息的差异，运用 Illumina 高通量测序技 术中的 HiSeq2000 平台，选择在不同生长时期的微拟球藻进行转录组学分析，然后从转 录组文库中获得油脂合成过程中的关键基因—丙二酰 CoA:ACP 转酰基酶基因片段，利 用 Race 技术获得该基因全长，并分析了微拟球藻(Nannochloropsis ganada)在不同生理 状态下脂肪酸组成及 MCAT 基因的转录表达变化。 转录组学研究表明：在微拟球藻(Nannochloropsis ganada)生长的指数期和平台期共 获得 29,203 条高质量 mRNA 序列片段。在指数期，有 9,745 条 mRNA 序列表达上调， 而在平台期有 7,305 条 mRNA 序列表达上调。指数期和平台期表达无差异的序列总共有 12,153 条。在 NCBI 数据库中，获得注释信息的序列有 13,775 条。而 KEGG 代谢通路 数据库注释表明：指数期获得了 238 条代谢途径注释，其中有 818 条序列在这些代谢途 径中表达上调。平台期获得了 248 条代谢途径注释，其中有 1,148 条序列表达上调。在 COG 数据库中有 11604 条序列（25 亚类）获得注释。这些注释主要涉及脂质代谢、糖 代谢、光合作用等等诸多生理生化过程。其中，指数期表达上调 4,135 条序列，在平台 期表达上调 5,015 条序列。 克隆结果表明：微拟球藻丙二酰 CoA:ACP 转酰基酶基因 5`-UTR 为 158bp，3`-UTR 为 452bp，编码蛋白区长度为 1059bp，NgMCAT 基因编码 352 个氨基酸，编码蛋白的分 子量为 37.22 kDa，等电点为 6.06。系统进化树及氨基酸序列同源性分析发现微拟球藻 丙二酰 CoA:ACP 转酰基酶的氨基酸序列和三角褐脂藻、海链藻等藻类丙二酰 CoA:ACP 转酰基酶氨基酸序列具有较高相似性。Real-time PCR 结果表明：在富氮培养时，NgMCAT 表达水平的变化不显著；而在缺氮条件下，NgMCAT 的表达量在初始的 12h 内，逐渐增 大，在 12h 时表达量最高，为初始 0h 的 5.17 倍。但从 12h 往后，NgMCAT 表达量则逐 步降低。在 72h 时候，NgMCAT 基因的表达量仅为对照组 0h 的 0.47 倍，在 12h 时表达 量达到最大值，为对照组 0h 的 2.35 倍。在低温下(15℃)下培养，NgMCAT 表达量先急 剧增加，在 6h 表达量最高，为 0h 的 4.25 倍。而后，随着培养时间的延长，NgMCAT 的表达呈降低趋势，并且在 36h 及 72h 均低于正常培养时该基因的表达量。其中， NgMCAT 在 72h 表达量最低，为 0h 的 0.75 倍。在富盐培养状态下，NgMCAT 的转录水 平呈现先上升后下降的趋势。 在正常培养及富盐培养条件下，微拟球藻(Nannochloropsis ganada)脂肪酸组成中的 C14:0, C16:1, C20:4, C20:5 随着培养时间的延长而逐渐上升，但是，C16:0, C18:2, C18:1, C18:0 等组 分则表现出相反的趋势。在低温培养条件下，C14:0 组分呈波动变化，而高温下则表现出 I 先升高后降低的趋势，其组分含量最大值在 24h。在低温及高温条件下，C16:0 组分均表 现很出随着培养时间延长而逐渐降低的趋势。但是在低温条件下降低速度更快。C18:0 在 低温及高温下均表现出先降低而后略微上升的趋势；在富氮条件下，C18:0 表现出上升趋 势；而在缺氮条件下，则表现出下降趋势。在限氮条件下，C16:1 的含量随着培养时间的 延长表现出显著的增长趋势；而 C18:0 和 C20:4 这两类组分则在富氮条件下随培养时间延 长而增长，而在缺氮条件下则表现出随培养时间延长而降低的趋势。在缺氮和富氮条件 下，C20:5 均表现出下降趋势，但在缺氮条件下，其下降速率表现的更为明显。 II Abstract Nannochloropsis ganada belongs to brown a