4个中药复方对鸡胚成纤维细胞安全浓度和生长影响.docVIP

4个中药复方对鸡胚成纤维细胞安全浓度和生长影响 　　摘要：将氧化苦参碱（OM）-黄芪多糖（APS）、OM-APS-栀子苷（GP）、甘草酸（GA）-APS和GA-APS-GP 等4个中药复方分别用MEM培养液溶解倍比稀释成1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.62、7.81、3.91、1.95 μg/mL 等10个浓度，再分别加入到培养24 h且已经长成单层鸡胚成纤维细胞（CEF）的培养体系中，通过MTT法测定4个中药复方对鸡胚成纤维细胞增殖的影响。结果表明，OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS-GP对CEF的安全浓度均为1 000 μg/mL，GA-APS为500 μg/mL；OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS在500～1.96 μg/mL，GA-APS-GP在500～3.92 μg/mL浓度范围内对CEF生长均有明显的促进作用，作用最强的是OM-APS-GP，其次是OM-APS、GA-APS和GA-APS-GP。 　　关键词：中药复方；鸡胚成纤维细胞；生长；安全浓度 　　中图分类号：S853.74文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）06-0149-03 　　收稿日期：2013-09-06 　　基金项目：国家科技支撑计划（编号：2008BADB4B06）；江苏青蓝工程骨干教师资助项目。 　　作者简介：邢玉娟（1964―），女，山东济南人，副教授，主要从事中药药理研究。E-mail：1903048595@。 　　通信作者：胡元亮，教授，博士生导师，主要从事中兽医学研究。E-mail：ylhu@。有研究证明，中药为一种免疫增强剂，具有来源广泛、效果显著、无毒副作用等优势，不仅能克服油乳类和铝胶类化学佐剂副作用大、局部刺激性强、致癌、制备和使用麻烦或不能足够提高弱抗原的免疫原性等弊病[1-2]，而且能显著增强机体的细胞免疫和体液免疫功能，促进免疫器官的发育和细胞因子的分泌[3-4]。 　　有试验证明，氧化苦参碱（oxymatrine，OM）和黄芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）在先于病毒加入细胞、后于病毒加入细胞和与病毒同时加入细胞等3种方式加入后均能抑制病毒生长，甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）在先于病毒加入和与病毒同时加入时有抑制病毒生长作用，栀子苷（geniposide，GP）只有在先于病毒加入时才能显现出一定的抑制病毒感染细胞能力的作用[5-6]。本试验选用体外试验对鸡新城疫病毒（NDV）呈现抑制作用的OM、APS、GP和GA，按一定比例分别组成OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS和GA-APS-GP等4个中药复方，通过MTT（四唑溴盐）法[7-11]测定4个中药复方对鸡胚成纤维细胞（chickembryo fibroblast，CEF）增殖的影响，为下一步体内试验作准备。 　　1材料与方法 　　1.1试验药物 　　根据以前的试验结果[5]，将OM、GA、GP、APS 等4种中药按一定比例组成OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS和GA-APS-GP等 4个复方，分别用MEM培养液溶解稀释成1 000 μg/mL，高压灭菌，4 ℃冰箱保存备用。临用前吸取各药0.5 mL至24孔细胞培养板第1孔中，加入细胞维持液 0.5 mL，倍比稀释至10孔。 　　1.2主要试剂 　　MEM细胞培养液，Gibco公司产品，按说明书配制，再加入犊牛血清（5%为细胞生长液、2%为细胞维持液），再按常规量加入0.03%谷胺酰氨和双抗（各100 IU/mL）；胰蛋白酶，进口分装，用PBS（pH值7.4）配制成0.25%的溶液，0.22 μm 混合纤维素酯微孔滤膜过滤除菌，分装，-20 ℃保存备用；MTT溶液，Sigma公司产品，用pH值为7.4的PBS液配制，使终浓度为2 mg/mL，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装，4 ℃冰箱保存，1 周内用完；裂解液二甲亚砜（DMSO），分析纯，江苏苏州工业园区正兴化工研究院生产。 　　1.3主要仪器 　　CO2培养箱，美国Revco公司生产；XSZ-DZ型倒置显微镜，重庆光学仪器厂生产；DG3022型酶联免疫检测仪，国营华东电子管厂制造；75-2A型微量振荡器，上海医用分析仪器厂生产；96 孔细胞培养板和24 孔细胞培养板，德国 Nunclon 公司生产。 　　1.4试验方法 　　按文献[12-13]的方法制备CEF。用细胞生长液调整细胞数至100万个/mL，在96 孔细胞培养板中加入 100 μL/孔，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，待CEF刚形成单层时加药。试验组分别加入不同浓度的中药复方 10