5氮2’脱氧胞苷对食管癌细胞系OE33中CDH13基因甲基化影响.docVIP

5氮2’脱氧胞苷对食管癌细胞系OE33中CDH13基因甲基化影响 　　摘 要 目的：观察去甲基化制剂5-氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-dC)对人食管癌细胞系OE33中CDH13基因启动子区甲基化状态的影响，探讨OE33中CDH13基因失活的机制及5-Aza-dC对CDH13基因表达的调控作用。方法：5-Aza-dC处理体外培养的OE33细胞，用甲基化特异性PCR(MSP)法检测处理前后细胞中CDH13基因的甲基化状态，半定量RT-PCR法检测用药前后细胞中CDH13 mRNA表达的变化。结果：OE33中CDH13启动子区发现甲基化现象，应用5-Aza-dC能使CDH13基因启动子区CpG岛去甲基化，而且经药物处理癌细胞后其CDH13 mRNA的表达较前明显增强。结论：去甲基化制剂5-Aza-dC能逆转CDH13基因甲基化状态，从而调控CDH13基因表达。? 　　关键词 5-氮-2’-脱氧胞苷 CDH13基因 食管癌 DNA甲基化? 　　doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.06.260? 　　CDH13是钙黏蛋白超家族中的一员，CDH13同时也是一种抑癌基因，具有强大的抗癌作用［1］，它的缺失和肿瘤的发生密切相关［2］。5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-dC)是目前最常用且作用最强的一种甲基化抑制剂。本研究应用5-Aza-dC干预培养的人食管癌细胞系OE33，观察干预前后CDH13基因启动子区甲基化状态及表达水平，为食管癌的药物治疗提供理论依据。 　　资料与方法 　　材料：①细胞系：OE33用含47.5%RPMI的1640培养基，加入含5%的胎牛血清的47.5%F-12，在37℃，5%CO?2的培养液中培养。收取细胞进行实验，以未加药物的细胞株作为对照。②试剂和仪器：胎牛血清和RPMI培养基购自GIBCO公司，5-aza-2’-deoxycytidine(Sigma公司)，RNA提取试剂及逆转录试剂盒Transzol，基因组DNA提取试剂(takara)，EZ DNA Methylation??TM? Kit(Zymo research)。 　　方法：①细胞培养：用含5%胎牛血清的RPMI培养基在37℃，5%CO?2，饱和湿度下孵育培养。将细胞以适宜密度接种，加入含5-Aza-dC的RPMI培养基，使其药物最终浓度5μM，每24小时更换新鲜含药培养基，药物浓度同前，连续作用5天后弃去药液，收取细胞进行实验，以未加药物的细胞株作为对照。②DNA提取：用DNAiso Reagent抽提细胞株中高纯度基因组DNA。紫外分光光度计测定核酸吸光度(A)值及DNA浓度。③DNA亚硫酸氢盐修饰：按EZ DNA Methylation??TM? Kit说明书进行操作。最后获得10μl TE缓冲液洗脱修饰好的DNA，-20℃保存。④RNA提取、逆转录：按全式金公司的说明书用Transzol提取细胞RNA。经凝胶电泳后，使用紫外分光光度仪检测提取的总RNA的质量和浓度，要求A260/A280≥2.0，并计算RNA含量。cDNA的合成反应体系20μl。取Oligo(dT)(0.5μg/μl)1μl，每一标本取总RNA 1μg，2×TSReaction Mix 10μl，TransScriptTM RT/RI Enzyme Mix 1μl，用不含RNAase的水不足至总体积20μl。42℃孵育30分钟，85℃加热5分钟失活TransScript。⑤引物设计和合成：CDH13上游引物：5’-TTCAGCAGAAAGTGTTCCATAT-3’；下游引物：5’-GTGCATGGACGAACAGAGT-3’［3］。GAPDH基因上游引物：5’-ACAGTCCATGCCATCACTGCC-3’；下游引物：5’-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’［4］。⑥PCR反应条件：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸30秒，共40个循环；72℃延伸5分钟。RT-PCR产物经2%琼脂糖胶分离。 　　统计学处理：用药前后比较采用配对?t?检验。Pearson统计方法分析基因甲基化与其表达之间的相关性，采用SPSS17.0统计软件包进行处理，?P?≤0.05为差异有统计学意义。 　　结 果 　　5-Aza-dC作用前后人食管腺癌OE33细胞CDH13基因启动子甲基化状态改变：MSP法检测用药前后CDH13基因启动子甲基化状态，干预前OE33细胞呈甲基化状态，干预后去甲基化，见图1。 　　5-Aza-dC作用前后人食管腺癌OE33细胞CDH13mRNA表达水平：RT-PCR检测用药前后CDH13mRNA水平，干预前OE33mRNA水