1―脱氧野尻霉素对家蚕中肠BmSuc1基因表达及其酶活性影响.docVIP

1―脱氧野尻霉素对家蚕中肠BmSuc1基因表达及其酶活性的影响 　　摘要：为研究1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，简称DNJ）对家蚕中肠BmSuc1基因表达及其酶活性的影响，以5龄第3天家蚕为试验材料，经口添食不同剂量的生物碱DNJ，采用实时荧光定量PCR方法检测中肠BmSuc1的表达情况，同时测定β-呋喃果糖苷酶的活性。结果表明，添食不同剂量的DNJ均能引起BmSuc1基因在添食6、9 h出现上调表达，但相对表达量有一定差异，添食4 μg/头的处理组在添食6、9 h基因的相对表达量分别是对照组的1.9、2.9倍，添食2 μg/头的处理组在添食6、9 h基因的相对表达量分别仅为对照组的1.5、1.8倍。另外，添食4 μg/头的处理组β-呋喃果糖苷酶活性在添食6、9、12 h显著高于对照组，而添食2 μg/头的处理组酶活性仅在添食6、9 h显著高于对照组。由结果可知，酶活性变化与基因的转录表达规律基本一致。 　　关键词：家蚕；DNJ；BmSuc1；β-呋喃果糖苷酶；实时荧光定量PCR 　　中图分类号： S881.2；Q786 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）11-0290-03 　　1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，简称DNJ）属于哌啶类多羟基生物碱，它能够抑制α-葡萄糖苷酶，具有一定的降血糖功能[1]。研究发现，多种植物、微生物中均有DNJ及其类似物存在[2-3]，其中桑树中生物碱DNJ的含量远高于其他植物[4-5]。 　　蔗糖是包括昆虫在内的动物非常喜好的主要糖营养来源，分解蔗糖的水解酶有2种：一种是催化葡萄糖侧基的α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase），另一种是催化果糖侧基的β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase）[6]。DNJ能够抑制α-葡萄糖苷酶活性，而对β-呋喃果糖苷酶没有抑制作用。DNJ能够通过抑制昆虫肠道α-葡萄糖苷酶活性，阻止其分解和吸收蔗糖营养，使其不能正常生长发育，甚至死亡[7]。已有研究表明，生物碱DNJ对非食桑昆虫卷心菜蛾、蓖麻蚕具有强烈的毒害作用[8-9]。 　　Daimon等率先在家蚕基因组中发现了β-呋喃果糖苷酶同源基因BmSuc1，其编码的中肠蛋白酶具有蔗糖水解酶功能，且活性不受DNJ的抑制[10]。桑树的叶片、枝条和根茎等部位富含DNJ[11]，寡食性昆虫家蚕一生以桑叶为食物来源[12-13]，它能够克服生物碱毒性，正常吸收桑叶中的糖营养，主要依赖β-呋喃果糖苷酶充分分解吸收桑叶中的蔗糖营养，从而成功地避开桑叶生物碱DNJ对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用[10]。 　　本研究通过添食外源DNJ，利用实时荧光定量PCR对家蚕中肠BmSuc1基因的表达进行定量检测和分析，同时测定β-呋喃果糖苷酶的变化规律，探讨外源DNJ对BmSuc1基因表达及其酶活性的影响，为深入研究家蚕回避桑叶生物碱DNJ毒害作用的适应机制提供一定的参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与主要试剂 　　供试家蚕品种为菁松×皓月，来自云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所。主要试剂：MiniBEST Universal RNA Extraction Kit和M-MLV反转录试剂盒（TOYOBO公司），FastStart Universal SYBR Green Master（Roche公司），生物碱DNJ（Sigma公司），蛋白定量测试盒和蔗糖水解酶测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），其他试剂为国产分析纯。 　　1.2 方法 　　1.2.1 添食处理及样品采集 选取发育良好、体质量和大小相当的家蚕5龄第3天幼虫，采用经口喂食的方法进行生物碱DNJ添食，其中A组喂食剂量为2 μg/头，B组喂食剂量为4 μg/头，以添食灭菌水的家蚕为对照，添食后在同等条件下?喂。 　　取添食后3、6、9、12、24 h家蚕的中肠组织，对照组同时取材，每次取样均分成2份，1份用于抽提RNA，另外1份用于制备酶液，每次取样均设3次重复，每个重复取5头蚕，样品收集后置于-80 ℃保存备用。 　　1.2.2 总RNA的提取及反转录 按照MiniBEST Universal RNA Extraction Kit操作说明提取中肠组织RNA。在核酸蛋白分析仪上测定D260 nm、D280 nm、D260 nm/D280 nm值，计算RNA样品浓度，根据M-MLV反转录酶使用说明书将抽提的RNA反转录成cDNA。另外取D260 nm/D280 nm值在1.80～2.00之间的样品，用于实时荧光定量PCR试验。 　　1.2.3 实时荧光定量PCR检测 利用Primer Premier 5.0软件，按照Real-Time PCR要求对选取