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2种海洋弧菌鉴定及人工感染大黄鱼病理分析 　　摘要：从形态学、生化特性、分子生物学水平对2种海洋弧菌进行菌种鉴定，将这2株菌制作成混合菌液，对大黄鱼进行攻毒试验。对2菌株16SrDNA进行PCR扩增，产物长度分别为1389、1477bp。利用BLAST进行比对，结果显示菌株090625的序列与哈维氏弧菌的同源性高达99%；而菌株070925的序列与副溶血弧菌同源性高达99%。攻毒试验发现，大黄鱼体亲鱼表皮下出血和肝脏、脾脏等组织都出现了典型的弧菌感染病症，大黄鱼幼鱼则未出现感染现象。菌株090625为哈维氏弧菌，菌株070925为副溶血弧菌。大黄鱼亲鱼比幼鱼更容易感染细菌。 　　关键词：菌种鉴定；哈维氏弧菌；副溶血弧菌；大黄鱼 　　中图分类号：S944文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0251-03 　　随着海水养殖业的蓬勃发展特别是高密度养殖模式的推广，养殖生物的细菌性疾病发生频率和发病范围逐渐增大。据调查，在细菌性疾病中，弧菌属细菌引起的疾病占很大比例。弧菌属细菌广泛存在于沿岸海水[1]、沉积物、海洋动物体中，被认为是海水鱼、虾、蟹类的一种常见致病菌[2-4]。大黄鱼（Pseudosciaenacrocea）隶属于鲈形目（Perciformes）石首鱼科（Sciaenidae），主要分布于中国、朝鲜沿海水域，为我国主要海产经济鱼类之一[3]。随着大黄鱼亲鱼培育和人工育苗等关键技术的突破，以及人工养殖技术的不断提高，大黄鱼养殖产业得到迅猛发展。但由于养殖规模扩大等原因，各种病害发生也日益频繁，尤其是细菌性疾病严重威胁着大黄鱼养殖业的健康发展[5-7]。本研究从患病中华乌塘鳢（Bostrychussinensis）内分离出致病菌，对大黄鱼进行人工感染，观察病症发生情况，旨在为大黄鱼临床诊断、致病机理研究奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1菌株来源2种海洋弧菌从患病中华乌塘鳢中分离。 　　1.1.2供试材料健康大黄鱼（均质量0.5kg）购自福建省宁德市养殖网箱；患病中华乌塘鳢（均质量0.5kg）由福建省东山县鑫宇海水养殖场提供；健康褐菖?（Sebastiscusmarmoratus，平均质量0.5kg）购自福建省厦门市大学路水产市场。 　　1.1.3试剂蛋白胨（tryptone，LP0042）、酵母提取物（yeastextract，LP0042）、TCBS培养基均购自英国Oxoid公司；RNAlater购自北京Bioteke公司；ExTaqDNA聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司。其他试剂均为进口或国产分析纯。 　　1.1.4仪器设备自动微生物检测系统（AMS）VITEKJR和自动微生物检测系统革兰氏阴性菌种鉴定卡为法国生物梅里埃公司产品；9700型PCR仪为美国PE公司产品；水平电泳槽为北京六一仪器厂产品；恒温培养箱为太仓市华美生化仪器厂产品；HVE-50型全自动高压灭菌锅为日本Hirayama公司产品；AFX-1002-P型艾科浦超纯水系统为台湾颐洋企业发展有限公司产品；血小板计数器为浙江玉环县求精医用仪器厂产品。 　　1.2方法 　　1.2.1菌株分离用1.5%无菌生理盐水反复清洗患病中华乌塘鳢体表。用75%乙醇拭擦体表，对取样部位进行消毒。用无菌接种环分别穿刺体表溃烂部位组织，取少量样品在TCBS培养基上划线，30℃培养1d。挑取优势菌落在TCBS培养基平板划线分离数次，直至获得纯培养物菌株1、菌株2。 　　1.2.2回归感染取15尾健康褐菖?置于水箱中，28℃海水充气暂养2d，每天换水1/2。暂养无异常后用于回归感染，将其中10尾鱼分为A、B2个试验组，另外5尾为对照组。用血小板计数法对菌株1、菌株2进行计数；用无菌生理盐水分别将菌株1、菌株2稀释，制成菌悬液1、菌悬液2，浓度均为1×1010CFU/mL。A组：每尾鱼腹腔注射0.2mL菌悬液1；B组：每尾鱼注射0.2mL菌悬液2；对照组：每尾鱼注射0.2mL灭菌生理盐水。观察、记录试验鱼发病及死亡情况。 　　1.2.3菌株再次分离取回归感染试验组中出现病灶的褐菖?体表溃烂部位样品，在TCBS培养基和LB培养基平板上划线分离数次，直至得到纯化菌株。 　　1.2.4菌株鉴定 　　1.2.4.1形态学观察利用肉眼直接观察细菌菌落的外部形态。 　　1.2.4.2生化特性鉴定从分离菌株中取单菌落，利用自动微生物检测仪VITEKJR的GNI鉴定卡进行生理生化鉴定，再分离菌株经自动微生物检测仪GNI鉴定卡，检测30个生化检测项目。 　　1.2.4.3分子生物学方法鉴定将单菌落用ddH2O溶解，用作PCR反应的模板。以16SrRNA的保守区设计引物，进行PCR扩增，其中正向引物为16S-F（AT