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2种绿藻玻璃化冻存研究 　　摘要：收集对数生长后期细胞，采用不同配方及浓度的玻璃化冻存液以及不同的冻存步骤对胶网藻HE01和小球藻HE07进行冷冻保存试验，通过复苏后的细胞存活率判断适合的冻存液和冻存步骤。结果发现，不同的微藻所需的冻存液不同。对HE01和HE07海洋微藻分别使用5% DMSO+15%乙二醇+25%蔗糖溶液和15% DMSO+15%乙二醇+25%蔗糖溶液做为冻存剂，4 ℃条件下30 min后，转入-20 ℃预冻存2 h，再-80 ℃过夜后投入液氮中保存，胶网藻HE01和小球藻HE07的冻存率分别为702%、7059%。复苏后微藻生长状况良好。 　　关键词：胶网藻；小球藻；玻璃化冻存；抗冻保护剂 　　中图分类号： S917文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）21-0183-03 　　收稿日期：2016-05-31 　　基金项目：国家自然科学基金（编号；广西自然科学基金（编号：桂科青0728019）；广西民族大学相思湖青年学者创新团队资助项目。 　　作者简介：刘红全（1975―），男，黑??江人，博士，副教授，主要从事植物分子生物学研究。E-mail：lhongquan@163com。 　　微藻结构简单、繁殖迅速、易于培养、能够产生多种生物活性物质，具有很好的开发前景。藻类的长时间培养容易引起藻种污染，生命力减退以及藻种的基因漂变1-2]，给藻种的保存、研究以及大规模培养带来众多不便。目前，在微藻保存中的方法有固定化保存，继代保存和超低温冻存法3]。这些方法在实际应用中有其弊端，如继代培养在多次接种过程中藻种容易污染和逐渐老化，生命力减退。固定化保种程序复杂，大多数微藻在培养后期常会从胶珠中溢出4-5]。自1985年Rall等首次将小鼠胚胎细胞运用玻璃化冻存的方式成功冻存6]以来，玻璃化冻存的应用越来越广。玻璃化冻存技术不仅可以克服在藻种多次接种下导致的污染、基因漂变问题，还可以在超低温条件下杀死有害细菌，实现藻种长期保存的目的7]。微藻玻璃化冻存的成功报道也越来越多8-10]。小球藻（Chlorella）具有很高的营养价值，胶网藻（Dictyosphaerium）产油脂量较高，对它们进行成功低温保存将为进一步开发利用这2种绿藻奠定基础。本试验对胶网藻和小球藻的玻璃化冻存进行了研究。 　　1材料与方法 　　11藻种来源及其培养 　　胶网藻HE01与小球藻HE07分离于广西沿海红树林的水样中。2种绿藻培养于F2培养基中，在（24±1）℃、光照度（4×40 W日光照射）、光―暗周期为12 h―12 h的条件下培养。取对数生长后期的藻液用于试验。 　　12抗冻保护剂的选择 　　JP3]在蔡小宁等的试验方法11]上做出改进，选取10% DMSO+10%乙二醇+30%蔗糖+F2培养基为玻璃化冻存液配方。分别在此基础上改变DMSO、乙二醇与蔗糖浓度。DMSO浓度梯度为5%、10%、15%、20%、25%；乙二醇浓度梯度为5%、10%、15%、20%、25%；蔗糖浓度梯度为10%、15%、20%、25%、30%。在单因素优化结果的基础上进行3因素3水平的正交试验，正交试验选用浓度为单因素优化最佳值与左右相邻值。 　　13玻璃化冻存 　　131预处理 　　将对数生长期的2种藻细胞置于4 ℃的环境下暗培养48 h。提高藻种的耐寒性。 　　132预平衡 　　取预培养后的藻细胞4 mL，经离心浓缩后分别加入稀释2倍的玻璃化冻存液和培养基预平衡5 min，离心去除平衡液，迅速加入玻璃化冻存液或培养基分装到2 mL的冻存管中，每管500 μL。 　　133冻存步骤对微藻冻存率的影响 　　分别将2种藻迅速放入到液氮罐中或者在4 ℃冻存30 min后，移到-20 ℃冻存2 h再移到-80 ℃条件下过夜后投入到液氮罐中。 　　134解冻和冻存液的去除 　　将在液氮中保存24 h后的藻种取出，立即放入40 ℃恒温水浴锅快速解冻。化冻后的微藻在无菌条件下室温平衡20 min后加入3倍体积培养基离心去除溶液，用培养基重复洗涤2～3次。 　　135冻存后的恢复培养 　　将去除冻存液的藻细胞接种到新鲜培养基中，暗培养1 d后转入到光照培养。 　　14藻细胞存活率的测定 　　参照Canavate等的方法12]，取恢复培养后的藻细胞接入F2培养基，培养4 d后，采用752型紫外分光光度计测定藻液的D680 nm值。并以未冻存的藻细胞作对照。 　　存活率=解冻后藻液的D680 nm值未冻存藻液的D680 nm值×100%。 　　2结果 　　21蔗糖浓度对冻存率的影响 　　未加入冻存液的2种藻的存活率均为0，可以看出2种微藻对超低温均没有耐受性。随着蔗糖的浓