A型肉毒毒素对增生性瘢痕组织中TGF―β1和I型胶原蛋白mRNA表达影响.docVIP

A型肉毒毒素对增生性瘢痕组织中TGF―β1和I型胶原蛋白mRNA表达影响 　　[摘要] 目的：探讨A型肉毒毒素（botulinum toxin A，BTXA）对增生性瘢痕组织成纤维细胞中TGF-β1和I型胶原蛋白表达的影响。方法：组织块法培养增生性瘢痕组织及正常皮肤组织的成纤维细胞，用不同浓度的BTXA作用于体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞，检测MTT值；将浓度为0.2U/ml、0.4U/ml、0.8U/mlBTXA作用于增生性瘢痕成纤维细胞48h，利用RT-PCR检测BTXA对TGF-β1和I型胶原蛋白mRNA的表达量。结果；BTXA在体外能明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖，随着药物浓度的增加及时间的延长，其抑制作用明显增强，能够减少TGF-β1和I型胶原蛋白mRNA的表达，且随着药物浓度的增加，TGF-β1和I型胶原蛋白mRNA的表达量呈下降趋势。结论：BTXA通过抑制瘢痕组织中成纤维细胞的增殖，减少TGF-β1和I型胶原蛋白mRNA的表达，减少细胞外基质的异常沉积来影响增生性瘢痕的形成。 　　[关键词] A型肉毒毒素；增生性瘢痕；TGF-β1；collagen I 　　[中图分类号]Q813.1 　　[文献标志码]A 　　[文章编号]1008-6455（2015）07-0040-04 　　A型肉毒毒素（botulinum toxin type A，BTXA）是由肉毒梭菌产牛的一种神经毒性药物，它能够持久的抑制神经肌肉接头处乙酰胆碱的释放而使肌肉松弛麻痹，其这一原理已用于治疗肌张力障碍及肌肉痉挛性的疾病。近来又有研究发现A型肉毒毒素并不只单纯作用于胆碱能神经末梢，在平滑肌和腺体亦可以通过抑制胆碱能或非胆碱能神经递质发挥作用。目前有研究用A型肉毒毒素治疗瘢痕及抑制瘢痕增牛取得了较好的临床治疗效果。本研究通过BTXA对体外培养的增牛性瘢痕成纤维细胞的形态和增殖变化的影响，以及TGF-β1和I型胶原蛋白mRNA表达的影响，为其在瘢痕防治领域里提供理论依据。 　　1 材料和方法 　　1.1实验材料 　　DMEM培养基（Gibco公司USA），BTXA（兰州牛物制品研究所），Trizol总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒（美国PROMEGA公司），taq酶购于日本TAKA-RA；MTT、DMSO购于SIGMA USA，新生小牛血清（天津TBD公司），光学显微镜，投射电镜，PCR 仪器。 　　1.2实验标本 　　标本取自本科室2012-2014年18例增牛性瘢痕患者手术切下的增牛性瘢痕组织及正常的皮肤组织，患者年龄14～45岁，平均年龄32岁；病程6个月～2年，患者3个月内均未经过免疫治疗，放射线治疗及激光治疗，取标本前均得到患者的知情同意。 　　1.3细胞培养 　　将增生性瘢痕组织及正常的皮肤组织标本在无菌室用含lOOU/ml青霉素和100ug/ml链霉素的PBS缓冲液反复冲洗3次后将其剪成0.5mm×0.5mm×0.5mm～lmm×1mm×1mm大小的小组织块，接种于含lO%胎牛血清的DMEM培养液的培养方瓶中，在37.0℃、5%（体积分数）的CO2孵箱中静置培养，根据细胞的牛长情况，每周更换两到三次培养液，待3周后原代细胞从组织块中长出并融合成致密的单层，进行传代，采用0.25%胰蛋白酶及0.02%乙二胺四乙酸消化，按l：4传代，药物实验所用细胞为3～6代。 　　1.4 MTT比色法检测各组细胞增殖情况 　　将对数牛长期的成纤维细胞制成5×l06悬浮液，以每孔100ul的成纤维细胞密度接种于96孔培养板中。置于37.0℃、5%（体积分数）的CO2饱和温度的孵箱中继续孵育24h。待细胞完全贴壁后去除培养液，分别加入含浓度（U/ml）0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 BTXA的10%小牛血清的DMEM 200ul，培养液每组设6个平行孔及空白对照孔，加药继续孵育48h后，每孔加MTT （5mg/ml） 20ul继续孵育3h后，弃掉上清液，每孔加200ul DMSO振荡混匀，用自动酶联免疫分析仪在没定波长492nm时测定其OD值。计算药物的抑制率（IR）： 　　IR=（1-实验组OD值/对照组OD值）×l00% 　　1.5总RAN的提取 　　将浓度为0.2 U/ml、0.4 U/ml、0.8 U/ml的BX―TA加入含有1×l06个/ml第3～6代细胞的培养瓶中，孵育48h，收获细胞。采用TRizol Reagent总RNA抽提试剂盒，操作步骤按试剂盒的操作指南进行。并电泳鉴定提取RNA的完整性。经检测所有样本260/280nm比值均大于1.8，提示样品纯度较高，-80℃储存。 　　1.6 MT-RT-PCR 　　TGF-β1、I型胶原蛋白和B-actin基因表达的变化采用半定量RT