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caveolin―1脚手架样结构域多肽对HEp2细胞迁移和侵袭能力影响 　　[摘要] 目的 研究caveolin-1脚手架样结构域（caveolin-scaffolding domain，CSD）多肽对HEp2细胞迁移和侵袭能力的影响，并探讨其分子机制。 方法 CSD多肽和乱序多肽由人工合成得到，并在N末端用生物素标记。用免疫细胞化学法检测CSD多肽在HEp2细胞中的渗透情况，划痕实验检测细胞的迁移能力，Transwell细胞体外侵袭实验检测细胞的侵袭能力；免疫印迹法检测HEp2细胞中FAK蛋白的表达水平及磷酸化程度。 结果 免疫细胞化学检测显示CSD多肽能够较好地进入HEp2细胞内；CSD多肽组HEp2细胞迁移能力明显低于乱序组和空白对照组（P均0.05）；CSD多肽组发生侵袭的细胞数明显低于乱序组和空白对照组（P均0.05）；免疫印迹法检测结果显示，CSD多肽组FAK相对磷酸化程度明显低于乱序组与空白对照组（P均0.01）。 结论 caveolin-1脚手架样结构域多肽可顺利进入HEp2细胞内，而且可以抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，FAK磷酸化水平的下调可能是其中重要的分子机制。 　　[关键词] Caveolin-1；粘着斑激酶；多肽；鳞状细胞癌；肿瘤浸润 　　[中图分类号] R73-3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）30-0029-04 　　Caveolin-1是人体细胞膜上重要的膜蛋白，它能够和许多信号转导相关蛋白结合，影响下游信号通路活性，从而调节细胞的生物学行为。在部分肿瘤的研究中，Caveolin-1基因的过表达可以抑制肿瘤细胞的生长。Caveolin-1蛋白结构中存在一个脚手架样的区域（caveolin-scaffolding domain， CSD），CSD是caveolin-1参与调节细胞膜蛋白生物学活性的重要区域，在细胞生命活动中发挥重要作用[1]。肽类药物因其具有特异性的靶向作用，正逐渐成为肿瘤治疗研究的热点[2]。本研究通过人工合成CSD多肽，观察其作用于喉鳞状细胞癌HEp2细胞株后，对肿瘤细胞的迁移和侵袭能力的影响，并初步探讨其机制。 　　1 材料与方法 　　1.1细胞及培养条件 　　人喉鳞状细胞癌HEp2细胞株购于美国ATCC公司，用含10%胎牛血清（hyclone公司，美国）的DMEM培养基培养，培养条件：37℃、5%CO2、饱和湿度。 　　1.2 CSD多肽的氨基酸序列与合成 　　CSD多肽氨基酸序列为DGI WKA SFT TFT VTK YWF YR，以同样的氨基酸种类和数量随机排列，并合成得到的乱序多肽做为阴性对照。多肽序列均由上海翱博生物科技有限公司合成，肽链N端连接生物素标记，多肽作用于细胞的终浓度为4.0 μM。 　　1.3 免疫细胞化学法检测多肽的细胞渗透效能 　　HEp2细胞贴壁生长至细胞密度为70%时，加入CSD多肽孵育6 h后，弃去培养液，加入冷丙酮固定10’，然后滴加碱性磷酸酶（AP）标记的抗生物素抗体（工作浓度1：300；Jackson Immuno Research公司，美国），在湿盒内37 ℃孵育2 h，用PBS冲洗后加入5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/四唑硝基蓝（NBT/BCIP；Roche公司，瑞士）显色。 　　1.4 细胞划痕实验 　　取2×105 HEp2细胞接种于六孔培养板中，当细胞生长至100%汇合时，换无血清培养液，实验组中加入CSD多肽，乱序多肽做为阴性对照组，无血清培养液为空白对照组。用移液器管嘴在细胞层轻轻划出约1 mm宽的划痕后继续培养，在0、24 h、48 h时镜下用Zeiss LSM Image Browser 3.1 软件（Mississauge公司，加拿大）测量划痕的宽度变化，细胞迁移率=（0 h划痕宽度-48 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。实验均重复3次。 　　1.5 Transwell细胞体外侵袭实验 　　实验使用Biocoat Matrigel Invasion Chamber试剂盒（BD公司，美国），根据试剂盒说明书操作，步骤简述如下：获得约5×103 HEp2细胞，接种于上层小室中，加入无血清培养液至300 mL，实验组中加入CSD多肽，乱序多肽做为阴性对照组，无血清培养液为空白对照组，37 ℃培养24 h后，用棉签把表层的细胞抹去，加入4%多聚甲醛固定30 min，800 μL Giemsa染液染色20 min，取出膜片至?@微镜下观察，随机选取10个400倍视野计数细胞。实验均重复3次。 　　1.6 免疫印迹法 　　细胞分为三组，实验组中加入CSD多肽，乱序多肽做为阴性对照组，无血清培养液为空白对照组，细胞培养24 h后，HEp2细胞用含有