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NR2F2在鼻咽癌中表达及其临床意义 　　摘要：目的 观察NR2F2基因的表达与鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）的关系。方法 采用实时定量rtPCR技术检测NR2F2基因在NPC细胞株（CNE1、CNE2、58F）和鼻咽上皮细胞株（NP69）中的表达；采用组织芯片技术通过免疫组化检测NR2F2在124例恶性鼻咽癌肿瘤、31例对应的癌旁正常组织和12例正常鼻炎粘膜组织的表达。结果 NR2F2 mRNA在NP69中表达水平较高，而在NPC细胞株中表达水平显著下降。正常鼻咽粘膜及癌旁组织中NR2F2蛋白染色阳性表达率约为72% （31/43）；而在鼻咽癌组织中阳性表达率约为31% （39/124）；NR2F2蛋白表达水平与肿瘤的侵犯范围（T）呈负相关（P0.05）。结论 NR2F2基因表达的抑制可能参与鼻咽癌的发生。 　　关键词：NR2F2；鼻咽癌；基因表达 　　鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国南方较高发的恶性肿瘤，严重危害公众健康。其病因目前尚不明确。患者初诊时常伴有颈部淋巴结转移，因此急需寻找能用于鼻咽癌早期诊断以及预后的生物标志物，为早期诊断和治疗提供线索。 　　NR2F2是1991年被识别的一个配体依赖性转录因子，为类固醇/甲状腺激素核受体家族中的一个新成员[1]。多项研究表明NR2F2可参与调节多个不同基因的表达，在控制组织和器官发育的过程中发挥重要作用[2-3]。近来有研究报道NR2F2在激素抵抗型乳腺癌细胞中表达受抑制，且该基因的表达与肿瘤组织分型呈负相关[4-5]，表明NR2F2表达下调可能参与肿瘤发生。 　　本研究通过对鼻咽癌细胞株和鼻咽上皮细胞株的NR2F2基因mRNA表达水平的检测并利用组织芯片配合免疫组化观察NR2F2蛋白表达在鼻咽癌组织和正常及癌旁组织的差异，探讨了NR2F2的表达与鼻咽癌之间的关系及其临床意义。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料 Trizol 试剂购自Invitrogen公司； 反转录酶购自 TaKaRa 公司；荧光定量PCR MIX（SYBR染料法）购自ABI公司。胎牛血清及 RPMI1640 培养基购自 Gibco 公司；组织芯片NPC961和NPC962购自西安艾丽娜生物科技有限公司；兔抗人NR2F2抗体（ab50487）购于 Abcam 公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购于碧云天生物公司。 　　1.2细胞培养 三株鼻咽癌细胞CNE1、CNE2、58F和一株鼻咽上皮细胞NP69由中山大学肿瘤中心康铁邦教授惠赠；用含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培养基在 5% CO2、37 ℃培养箱内培养。 　　1.3 rt-PCR 检测NR2F2 mRNA 的表达 Trizol 提取总RNA，采用反转录酶（TaKaRa）按说明书合成cDNA。PCR 扩增引物由华大生物技术有限公司合成： NR2F2基因引物上游： 5- CCATAGTCCTGTTCACCTC -3，下游： 5- GCTCCTAACGTATTCTTCCA -3，产物长度104bp； actin引物上游： 5-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT -3，下游： 5-GCTGTCACCTTCACCTTTCC -3，产物长度268 bp。采用20 μL的反应体系，每个样本重复3次，求平均Ct值作为实验结果。反应过程具体为： 95℃预变性3 min；95℃变性13 s，59℃退火和延伸45 s，扩增40个循环。计算ΔCT=Ct（NR2F2）-Ct（actin）；再根据ΔΔCT=ΔCT（肿瘤细胞株）-ΔCT（NP69），进一步计算NR2F2在肿瘤细胞株与NP69之间表达倍数的差异。 　　1.4组织芯片及免疫组化分析 组织芯片NPC961和NPC962包含124例原发性鼻咽癌肿瘤、31例对应的癌旁正常组织和12例正常鼻炎粘膜组织。组织芯片经二甲苯脱石蜡，乙醇再水化，PBS清洗，至于0.01 M柠檬酸缓冲液（pH 6.0）在微波炉中加热使抗原复活，3% H2O2中室温浸泡10min封闭内源性过氧化物酶活性，抗-NR2F2于4℃孵育过夜，滴加二抗工作液，DAB显色剂显色，苏木精复染后，中性树胶封片，于普通显微镜下观察。 　　1.5统计学分析 计数资料相关性分析及率的比较用Pearsons χ2检验或Fishers精确检验（SPSS 19.0版统计软件）。 　　2结果 　　2.1 NR2F2在鼻咽癌细胞株中的表达 为了比较NR2F2在鼻咽癌细胞和正常细胞间的表达差异，我们分别利用实时定量rt-PCR比较了高分化型鼻咽癌细胞株CNE1、低分化型鼻咽癌细胞株CNE2、高转移型鼻咽癌细胞株58F和鼻咽上皮细胞株NP69中NR2F2的mR