Nrf2ARE信号通路在外伤性脑损伤神经保护作用机制研究.docVIP

Nrf2ARE信号通路在外伤性脑损伤神经保护作用机制研究 　　[摘要] 目的 初步探讨Nrf2-ARE通路在外伤性脑损伤保护作用的机制。 方法 采用基因敲除大鼠制作创伤性脑损伤模型。将72只实验大鼠分为假手术组（Nrf2+/+）、脑损伤组（Nrf2+/+）、假手术组（Nrf2-/-）和脑损伤组（Nrf2-/-），每组18只。损伤36 h后，采用TUNEL法检测神经细胞凋亡及ELISA蛋白羰基试剂盒检测蛋白质氧化损伤程度。 结果 假手术组（Nrf2+/+）大鼠与假手术组（Nrf2-/-）大鼠相比，脑组织蛋白羰基浓度及神经细胞凋亡率均无显著差异（P 0.05）；而脑损伤组（Nrf2+/+）大鼠及脑损伤组（Nrf2-/-）大鼠的脑组织蛋白羰基浓度及神经细胞凋亡率分别比假手术组（Nrf2+/+）大鼠与假手术组（Nrf2-/-）大鼠高，差异有统计学意义（P 0.01），但脑损伤组（Nrf2-/-）大鼠的相关指标较脑损伤组（Nrf2+/+）明显增高，差异有统计学意义（P 0.01）。 结论 Nrf2-ARE通路可能通过减低外伤性脑损伤中脑组织蛋白羰基的浓度，减少神经细胞的凋亡，从而发挥神经保护作用。 　　[关键词] 外伤性脑损伤；Nrf2-ARE通路；氧化应激；神经保护 　　[中图分类号] R651.1+5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）11-0011-03 　　外伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）指由外伤因素所致严重脑组织损害的一类疾病，已严重影响人类的健康[1]。其中，TBI后神经元继发性损伤（secondary brain injury，SBI）是造成脑损伤发生、发展的重要原因[2]。近年来，有研究者认为氧化应激损伤在外伤性脑损伤机制中占有重要的地位[3]。有研究结果表明Nrf2-ARE通路可能参与了TBI后内源性应激防御机制[4，5]，但其神经保护作用机制尚未得到完全阐明。因此，本研究采用外伤性脑损伤大鼠模型，观察Nrf2-ARE通路对TBI后大鼠神经细胞凋亡及氧化应激损伤指标的作用，探讨该通路在TBI后发挥神经细胞保护作用的相关机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物 　　（Nrf2-/-）大鼠及（Nrf2+/+）大鼠由浙江大学医学院动物实验中心提供。其中，前者DNA基因的引物序列为5’-GCGGATTGACCGTAATGGATAGG-3’，而后者DNA基因的引物序列为5’-CGCCTTTTCAGTAGATGGAGG-3’。所有大鼠均在自由饮食条件下饲养。 　　1.2 试剂和仪器 　　原位末端标记（TUNEL）试剂盒（Promega公司）；ProteinCarbonyls ELISA Kit试剂盒（RD Systems公司，美国）；多功能酶标仪（BioTek 公司，美国）；Labo fuge 400R高速离心机（Heraeus公司，德国）；电子显微镜（OLYMPUS，日本）等。 　　1.3 动物模型制备及大鼠分组 　　采用BenchmarkTM法制备TBI动物模型[6]。过程如下：麻醉成功后，暴露颅骨。距矢状缝中线右1 mm，在人字缝与冠状缝处钻孔，直径约0.4 cm，打开硬脑膜。将撞击器装配在立体定位仪上，将撞击器的头端与冠状面平行，而与大鼠头颅矢状面呈8°角度垂直固定于硬脑膜上。采用2.5 mm直径的撞击头，以3.5 m/s撞击速度、0.8 mm打击深度、90 ms打击时间制作中度外伤性脑损伤。假手术组大鼠无冲击损伤过程，其余步骤同模型组。将基因敲除大鼠分四组：假手术组（Nrf2+/+组）、脑损伤组（Nrf2+/+组）、假手术组（Nrf2-/-组）和脑损伤组（Nrf2-/-组），每组18只。18只大鼠均在损伤36 h后处死，其中9只取右侧损伤灶脑组织，-70℃冰箱保存，待脑组织蛋白羰基的浓度检测；其余9只行TUNEL染色并在光镜下（×400）观察凋亡细胞。 　　1.4 指标检测 　　1.4.1 组织蛋白羰基浓度测定 严格按ProteinCarbonyls ELISA试剂盒步骤说明书操作测定。 　　1.4.2 TUNEL染色 严格按照试剂盒检测步骤进行操作。TUNEL染色在光镜下（×400）观察凋亡细胞（以胞核出现棕黄染色颗粒代表），计算TUNEL阳性率即TUNEL阳性细胞数占总细胞数的比值并采图。 　　1.5 统计学处理 　　采用SPSS 17.0统计学软件，所有数据均以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，相同基因型或不同基因型间两两比较均采用配对t检验，P 0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 组织蛋白羰基浓度比较 　　3 讨论 　　有研究表明，Nrf2作为一个重要的细胞内